背景自体骨移植仍是目前临床骨缺损修复的最有效方法,但自体骨移植造成供骨区“二次创伤”,且取骨量有限,尤其不适用于老年人及未成年人,故研究替代自体骨移植的方法具有重要的临床意义和社会意义。自体骨的成骨作用主要归因于下述特性:1)成骨特性,成骨前体细胞/骨祖细胞能够分化为成熟的成骨细胞;2)骨诱导性,生长因子能够刺激成骨前体细胞/骨祖细胞分化为成骨细胞和破骨细胞;3)骨传导性,支架材料提供必要的支撑作用。骨髓已在临床治疗大段骨缺损、骨不连中常态化应用,临床实践已证实在骨移植材料中加入骨髓,骨缺损修复的成骨效果明显提高,这是因为骨髓中含有自体骨成骨的两大特性,即含有大量的可分化为成骨前体细胞或骨祖细胞的干细胞(如间充质干细胞,mesenchymal stem cells,MSCs)等,还含有具有骨诱导性的多种生长因子成份(如骨形态发生蛋白,BMP;血管内皮生长因子,VEGF;血小板源性生长因子,PDGF)等。骨传导性主要是自体骨的三维空间结构包括孔径、孔隙率、力学传导等支架性能,最能模拟自体骨骨传导性的支架材料为同种异体脱钙骨基质(Decalcified bone matrix,DBM),目前用于临床的其它支架材料还包括磷酸三钙(TCP)、羟基磷灰石(HA)、聚乳酸等高分子聚合物、珊瑚等天然材料。自体骨的三个成骨特性相辅相成,缺一不可,如干细胞分化的骨祖细胞是后期继续分化为成骨细胞(或破骨细胞)的核心细胞,生长因子在诱导细胞定向分化的过程中发挥重要的调控作用,支架的空间结构和生物力学传导性能在细胞的粘附、生长、分化及新生骨组织的生长调控等多方面发挥重要作用。近年来,研究自体骨应用的替代方式成为骨研究领域的一大热点和难点。主要研究方向有以下方面:1)组织工程骨(Tissue engineering bone,TEB):其构建方法融合了自体骨的主要特性,以种子细胞复合生长因子赋予支架材料必要的成骨特性,为骨缺损尤其是大段骨缺损的修复重建带来了新的希望。但干细胞体外培养及扩增周期长、技术要求严格、治疗费用较贵及移植伦理等限制其临床应用及产业化;2)骨髓局部注射:直接抽吸患者的骨髓(多为髂骨骨髓)在骨修复区注射,在治疗骨囊肿、骨不连等疑难病例中取得了较好的疗效,但骨髓的抽吸量较多(约200-300ml/次),需要多次注射(2-3次),面临的瓶颈问题是大量骨髓抽吸后的未知风险以及患者的临床接纳性不高等;3)干细胞局部注射:通过密度梯度离心的方法,抽吸患者的自体骨髓在体外离心后注射到局部骨修复区,此方法在治疗股骨颈缺血性坏死、骨不连中取得了令人欣慰的疗效,但同时面临诸多难以克服的问题:如抽吸的骨髓量相对较大(总量约200-300ml),离心分离过程中需要添加外源性的生物试剂,操作过程中可能的污染风险等;4)富含血小板的血浆局部注射:抽取患者外周血(或骨髓)后,通过密度梯度离心法分离出血浆,将高浓度的血浆在骨修复区局部注射,此方法可适用于大多数骨修复困难患者,但也面临较多的技术难题和临床风险:如血浆分离过程添加外源性生物制剂的潜在风险、需要多次注射、作为流体的血浆注射骨修复区后在局部的滞留浓度会快速降低、需要专业的仪器设备等。上述诸多方法均面临临床潜在风险较大、患者接纳障碍等多重难题。根源于自体骨和组织工程骨的构建理念,选择性细胞滞留(selectivecellretention,scr)技术应运而生,scr技术可将自体骨髓中的干细胞、生长因子、血小板等成骨成份快速整合到支架材料中,即刻移植体内骨缺损区,整个操作流程可与手术同步进行,所有操作均可在手术台上完成。因此,scr技术既可避免干细胞的体外扩增培养及伦理难题,又能避免现有富集技术因外源性生物试剂带来的潜在风险,是一种高效、安全、简便的新方法,更适用于临床,且易于产业化,为研究自体骨移植的替代方法提出了新的思路。scr技术的核心是增加骨移植材料对骨髓中功能干细胞、成骨相关生长因子等成份的快速粘附。在现阶段的临床用骨移植材料中,单一材料很难实现这一要求。通过对现有骨材料涂层或表面改性等修饰是常用的方法,我们设想将临床骨移植材料中最常用的同种异体脱钙骨基质(dbm)通过仿生学改性来增加其对骨髓中有效成骨成份的粘附能力。临床实践中,dbm的应用量仅次于自体骨。但dbm在制备过程中因脱钙、脱蛋白等操作导致其孔径过大、表面结构受损,均不利于骨髓中细胞和因子的粘附。使用可模拟细胞外基质(extracellμlarmatrix,ecm)且安全性高的短肽rada16-i对dbm表面仿生修饰是一种较佳的选择。rada16-i肽(序列:acn-radaradaradarada-conh2)是一种纳米自组装短肽(self-assemblypeptide,sap),成份为16个氨基酸单体,重复序列为精氨酸(arginine,r)-丙氨酸(alanine,a)-天冬氨酸(asparticacid,d)。rada16-i肽在生物体内最终降解产物为氨基酸单体,体内外实验已证实其风险低、无明显的免疫原性。rada16-i肽在人体的生理条件下,遇ca2+、mg2+等阳离子触发,即可启动自组装过程,形成三维(threediamensions,3d)的纳米网状纤维水凝胶,含水量超过90%,具有一定的机械强度,是干细胞、成纤维细胞、内皮细胞等适宜的立体生长微环境。rada16-i可在dbm孔隙内自组装成水凝胶,能均分dbm的孔径、缩小孔隙,在scr作用下增加对细胞、因子、血小板等成份的物理拦截作用,而且rada16-i肽自身氨基酸单体所带的正负电荷,可通过静电间的吸附作用粘附骨髓中的多种细胞及因子成份;同时rad序列也被认为是整合素粘附的有效位点。因此,本论文的研究,首先尝试用自组装肽rada16-i修饰dbm,并分析sap/dbm复合物的表征及稳定性;其次,通过scr技术构建的sap/dbm微环境,评价mscs在微环境中的成骨分化;通过体内模型评价scr技术构建的sap/dbm复合物促进裸鼠异位及山羊原位临界骨缺损的修复效果;最后,探寻scr技术构建的sap/dbm复合物促进骨修复的可能机制。目的1.用自组装短肽rada16-i修饰dbm,分析sap/dbm的表征、稳定性等特性,为scr技术寻求理想的支架材料;2.通过体外mscs在sap/dbm微环境中的成骨分化及体内异位、原位骨修复研究,评价scr技术下sap/dbm的成骨效果;3.进一步应用蛋白芯片技术等探寻scr技术下sap/dbm复合物促进骨修复的可能机制。方法1.利用rada16-i肽的自组装特性,在pbs阳离子的触发下,启动自组装程序修饰dbm,形成sap/dbm复合材料。通过原子力显微镜(atomicforcemicroscopy,afm)观察肽的自组装效果,环境扫描电镜(esem)观察其微观形态并测定孔径,x线光电子能谱(xps)对其构成元素进行定性和定量检测,并进一步利用氨基酸对紫外光的敏感性,通过紫外分光光度仪全波长光谱分析sap/dbm复合物的稳定性。2.采用密度梯度离心法分离、培养羊(人)骨髓间充质干细胞(bmscs),通过mtt法检测bmscs在sap/dbm复合支架上的细胞增殖情况,并将bmscs接种于scr技术构建的富集骨髓的sap/dbm微环境,通过激光共聚焦显微镜形态学观察、荧光实时定量聚合酶链反应(rt-pcr)定量测定等方法评价sap/dbm微环境对bmscs的生长及成骨分化能力的影响。3.制备裸鼠髂骨旁臀肌肌袋内异位成骨模型,通过micro-ct定量计算、he及masson组织学染色评价scr技术构建的sap/dbm复合物的骨修复效果;并制备更具说服力的大动物原位骨缺损模型,综合运用x线、ct(micro-ct)、组织学染色等多种方法,评价scr技术下sap/dbm复合物在术后8周、16周对山羊股骨中段2cm临界骨缺损的修复效果。4.通过流式细胞技术分析scr技术下sap/dbm对骨髓中细胞的富集效果(评价指标包括粘附率、富集倍数等),免疫组化染色标记特异性细胞,高通量蛋白芯片技术分析sap/dbm富集的蛋白种类及含量,结合裸鼠股四头肌肌袋内异位成骨模型,借助pcr技术分析成骨基因的表达水平,根据上述结果,并进一步利用蛋白芯片筛选技术分析上述结果中高表达水平的生长因子或蛋白分子在动物体内的表达水平、变化趋势及与其相关的蛋白间的相互关系。结果1.在阳离子触发下,肽rada16-i可成功完成自组装,形成形状规则的立体纳米网状纤维结构,交织纤维形成的孔径多数在5~500nm,浓度0.5%、1%(w/v)的肽自组装效果较理想。esem显示sap/dbm的孔径为(20.22±6.726μm),为细胞的截留提供了物理结构;xps通过不同材料的元素分析表明rada16-i与dbm的整合性良好;紫外分光光度仪分析结果显示sap/dbm复合物具有良好的稳定性。2.bmscs典型特征为核浆比大,呈梭形或仿锥形,原代细胞生长较慢,第1代后生长旺盛。cck-8试剂检测细胞增殖情况,发现羊骨髓间充质干细胞(gmscs)在sap/dbm支架上的增殖趋势明显优于dbm;细胞通过罗丹明-鬼笔环肽-dapi染色后,共聚焦显微镜观察发现sap/dbm复合支架上有更多的细胞,生长方向深入sap网状结构内部,铺满整个sap/dbm支架,而细胞在dbm支架多沿孔壁生长,铺展区域局限性明显;浓度0.5%、1%(w/v)的sap与dbm组成的复合支架对gmscs的生长情况无明显影响。rt-pcr发现浓度为0.5%、1%的肽构建的不同微环境可能对mscs的成骨基因表达趋势具有一致性;7d时,sap/dbm与dbm微环境上部分基因如opn的表达水平未示显著的统计学差异,14d时,sap/dbm上ocn和opn基因的表达水平高于dbm,二者差异有显著统计意义(p<0.05),其可能原因在于sap的纳米交织纤维结构构成的天然缓释系统对成骨因子具有储存、释放功能。3.在裸鼠异位成骨实验中,术后8w,sap/dbm组的新生骨诸多评价指标如骨量与骨体积比值(bv/tv)、骨小梁数量(tb/n)、骨密度(bmd)均高于dbm组,二者间的差异有显著的统计学意义(p<0.05,n=8),组织学切片染色与micro-ct结果相互印证,进一步说明sap/dbm组新生骨的成熟度明显优于dbm组。在羊股骨临界骨缺损修复中,术后16w,sap/dbm组在骨修复区的皮质骨重塑非常完整,新生骨形态接近正常骨组织,且骨纤维结构排列整齐,而DBM组呈现不完整愈合,新生骨呈现板层骨和编织骨混存结构,骨塑形尚不完全。同时发现浓度0.5%、1%的肽构建的复合物在成骨效果方面无明显差别,都具有良好的骨修复能力。4.综合分析骨髓中细胞种类、不同种类细胞的粘附率、不同种类细胞的富集倍数等结果,认为SAP/DBM复合材料对骨髓中功能细胞的富集效果明显优于DBM;ESEM示SAP/DBM可均匀粘附骨髓中较多的有核细胞,而DBM仅粘附较多的红细胞和少量的有核细胞;这与HE染色结果相一致;免疫组化染色示SAP/DBM对单核细胞(CD14+)、造血干细胞(CD34+)、MSCs(CD73或CD90+)的粘附比例均明显大于DBM;蛋白芯片结果示SCR技术构建的SAP/DBM中富集的生长因子主要包括BMP-6、PDGF-BB、VEGF、EGF(浓度均>10pg/ml);SAP/DBM体内移植后PCR结果示Wnt/β-catenin/Runx-2信号通路可能在其成骨过程中发挥重要作用;进一步的蛋白芯片结果分析SCR技术富集的因子同信号通路相关分子间的关系时发现高浓度的PDGF-BB可能通过Akt信号激活NR4A1/SP1复合体募集宿主内源性的MSCs向骨修复区定向迁移,继而促进骨修复。结论1.自组装肽RADA16-I是一种良好的DBM仿生修饰材料,在生理条件下可自组装成纳米网状纤维结构,形成稳定的SAP/DBM复合物,其优良特性为体外细胞生物学研究和体内骨修复实验提供了基础。2.BMSCs在SAP/DBM复合支架上的增殖趋势明显优于DBM支架,SCR技术构建的富集骨髓的SAP/DBM微环境较DBM更能诱导MSCs向成骨方向的分化。3.SCR技术快速构建的SAP/DBM在裸鼠髂骨肌袋异位成骨中效果显著,在大动物原位骨缺损修复中,更能促进山羊股骨2cm临界骨缺损修复,同时明确了浓度0.5%和1%的肽构建的微环境对大动物原位骨缺损的修复效果无明显差别。4.SCR技术快速构建的SAP/DBM的骨修复机制在于富集有较多的干细胞及较高浓度的生长因子,Wnt/β-catenin/Runx-2信号通路在骨修复中发挥重要作用,而PDGF-BB可能通过Akt信号激活NR4A1/SP1复合体募集宿主内源性的MSCs向骨修复区定向迁移,进一步发挥骨修复作用。