铁是生物体不可缺少的微量元素,普遍存在于生物体各个组织中。铁蛋白(Ferritin)是一种广泛分布并且在调节铁储存与运输、抗氧化胁迫、细胞循环和抗病原菌等方面发挥关键作用的铁结合蛋白。近年来,昆虫铁蛋白在参与免疫应答调节方面备受关注。本研究对蓖麻蚕铁蛋白及亚基进行功能分析,期望能够对昆虫铁蛋白的研究做出一定程度上的补充。本研究克隆了编码蓖麻蚕铁蛋白重链亚基(ScFerHCH)和轻链亚基(ScFerLCH)基因的cDNA序列;分离出蓖麻蚕铁蛋白复合体及其亚基;获得了ScFerHCH和ScFerLCH的组织表达模式、应答铁离子和病原菌刺激的表达模式。体外构建了重组蓖麻蚕铁蛋白亚基自组装复合体,并确认复合体及各亚基与病原菌的结合。具体研究结果如下:1、蓖麻蚕铁蛋白重链亚基(ScFerHCH)和轻链亚基(ScFerLCH)的生物信息学分析基于蓖麻蚕转录组数据,鉴定并分析了 ScFerHCH和ScFerLCH的cDNA核苷酸序列及编码的氨基酸序列,确定了ScFerHCH和ScFerLCH的信号肽和ORF阅读框的位置。同源性分析表明,蓖麻蚕铁蛋白亚基与家蚕铁蛋白亚基有很高的同源性,并且在三维结构上也十分相似,推测二者具有相似的功能。ScFerHCH和ScFerLCH都具有铁反应原件,但只有ScFerHCH具有铁氧化酶中心。2、蓖麻蚕铁蛋白复合体的提取和亚基的分离鉴定以Native-PAGE的方法从蓖麻蚕幼虫血液中分离出铁蛋白复合体,再以Western-blot和MALDI-TOF/TOF MS证明其由两种不同类型的亚基(ScFerHCH和ScFerLCH)构成。3、ScFerHCH和ScFerLCH的组织表达模式分析以RT-qPCR和Western-blot从转录水平和蛋白水平分析了 ScFerHCH和ScFerLCH的组织表达模式,结果表明ScFerHCH和ScFerLCH广泛存在于蓖麻蚕的各个组织中,且在中肠、脂肪体、血液和丝腺中都有很高的表达量。4、ScFerHCH和ScFerLCH铁离子螯合能力、抗氧化能力和应答铁离子刺激的表达模式分析重组ScFerHCH蛋白可以螯合游离的铁离子,也表现出抗氧化剂H202的能力。但是重组ScFerLCH蛋白并不能螯合游离的铁离子,也没有抗氧化的能力。铁离子刺激后,ScFerHCH和ScFerLCH的表达量在中肠、血液和脂肪体中都出现了明显的上调表达。5、重组ScFerHCH和ScFerLCH蛋白的体外自组装及应答病原菌的能力分析复性后的重组铁蛋白亚基在体外可以自组装形成复合体,该复合体的螯合铁离子的能力显著高于重链亚基。复合体和两类亚基都可以与多种病原菌结合,但是并不能直接抑制病原菌的生长。当S.aureus和P.aeruginosa刺激蓖麻蚕时,ScFerHCH和ScFerLCH的表达量出现了明显的上调。综上所述,本研究首次从蓖麻蚕幼虫血液中提取出铁蛋白复合体并分离了两个组成亚基,并证明了 ScFerHCH具有螯合铁离子和抗氧化的能力,ScFerHCH和ScFerLCH应答铁离子刺激时组在织中表达量都明显上调;研究还证明了铁蛋白亚基能够参与病原菌的免疫刺激;此外,我们还发现重组铁蛋白亚基在体外可以自组装形成复合体,复合体及亚基都可以与病原菌结合,但不能直接抑制病原菌。以上结果为进一步研究蓖麻蚕铁蛋白生物学功能和参与免疫应答分子机制提供了一定的科学依据。