背景:RUNX1-205是人RUNX1基因的一个新型剪接异构体。与RUNX1b相比,RUNX1-205因其选择性剪接而缺失6号外显子,并且在卵巢癌的发生中起关键作用。然而其在人类造血中的功能尚不清楚,相比已经深入研究的RUNX1a/b/c,这可能是人类RUNX1基因剪切异构体研究最后空白的领域。RUNX1b基因在早期过表达强烈的抑制中胚层向造血的转化,同时强烈地下调了很多HOX基因家族成员,其中包括HOX49和HOXC4基因,这些基因在造血和白血病发生中起着广泛的调控作用。方法:本实验利用独特的hESC与AGM-S3共培养体系,以及基于转座子载体PiggyBac的PB-tet-on-OE诱导表达系统,探究RUN1-205,HOXA9和HOXC4在造血发生过程中的作用。在造血发生的不同时期添加Doxycycline(DOX)诱导目标基因过表达来探究它们对于造血发生的影响。结合细胞生物学方法(流式细胞术、免疫荧光染色、MGG染色、集落培养等)和分子生物学方法(蛋白免疫印迹实验、qRT-PCR、RNA-seq等)来阐明其在造血发生中的功能。结果:1、D0诱导RUNX1-205过表达不会影响中胚层细胞的产生,.但是严重抑制了中胚层向造血的转变;在后期(晚于D6)的过表达不会对造血发生产生抑制作用,甚至对造血有一定促进作用。RUNX1-205的蛋白稳定性较RUNX1b高。2、D0诱导HOXA9过表达会严重抑制早期CD34+细胞的产生及其衍生的成体造血相关亚群CD34+CD43+、CD34+CD45+的产生。D4或更晚诱导HOXA9过表达显著促进造血的发生。其中对CD34-CD45+细胞的促进效应是最明显,表明其可能强烈促进髓系祖细胞的产生。D4开始诱导HOX49过表达,在D14时CD45+细胞S期细胞比例显著提高,同时NF-κB信号通路也被上调。所有这些效应都可以通过添加NF-κB信号通路抑制剂(QNZ)来消除。3、D0诱导HOXC4过表达,对CD34+细胞没有显著影响,但是抑制其衍生的后续成体造血相关群CD34+CD43+和CD34+CD45+的产生。D6或更晚(特别是D10)诱导HOXC4过表达,可显著促进共培养系统中的造血发生,促进大多数造血祖细胞(包括髓系祖细胞和红系祖细胞)的增殖,特别是CD34-CD43+细胞。CD34-CD43+细胞可明显地分为CD34-CD43low和CD34-CD43high亚群,分化功能检测实验表明CD34-CD43low具有更高的髓系分化潜力,CD34-CD43high具有更高的巨核细胞和红系分化潜力。从D10开始诱导HOXC4过表达,在D14时CD43+细胞的S期细胞比例显著提高,同时NF-κB信号通路被上调。所有这些效应都可以通过添加NF-κB信号通路抑制剂(QNZ)和NF-κB1 siRNA来消除。结论:1、早期如D0(或D2)诱导RUNX1-205过表达会抑制CD34+细胞的生成,而在中后期如D6或更晚诱导RUNX1-205过表达对造血没有抑制作用,甚至会促进造血。RUNX1-205的蛋白较RUNX1b稳定。2、从D4或更晚诱导HOXA9过表达可以有效地促进造血发生和髓系祖细胞生成,其可能是通过上调NF-κB信号和改变细胞周期状态来实现的。3、从D6或更晚(特别是D10)诱导HOXC4过表达可以有效地全方面促进造血作用,特别是促进CD34-CD43high细胞群(包含红系和巨核祖细胞)的产生,其可能是通过上调NF-κB信号和改变细胞周期状态来实现的。