研究背景:恶性肿瘤是威胁人类生命和健康的重大疾病之一,近年来肿瘤发病率逐渐上升,死亡率也居高不下,并且发病年龄呈年轻化的趋势。根据2018年的全球癌症报告,发病率最高的分别是肺癌、乳腺癌、前列腺癌以及结直肠癌。除了遗传因素,环境污染和辐射暴露等也是常见的致癌因素。尽管近年来肿瘤的基础研究和临床治疗取得了较大的进展,但仍然缺乏高效特异的早期诊断指标和治疗方法,再加上肿瘤容易复发和转移的特性,所以大部分肿瘤患者的预后都比较差。因此,深入研究恶性肿瘤发生发展的机制,鉴定一些辅助肿瘤早期诊断的生物标志物,以及发现肿瘤治疗的新靶点等对于肿瘤的预防和治疗都具有十分重要的意义。近期,越来越多的研究表明肿瘤可以通过对自身能量代谢的重编程而获得生长和进展优势。肿瘤细胞即使在氧气充足的条件下,仍然以糖酵解为主要供能方式,这种对葡萄糖利用方式由氧化磷酸化转变为糖酵解的代谢特征也称为“Warburg效应”。有氧糖酵解作为肿瘤的重要标志已被广泛认可,几乎所有肿瘤中都被证实存在“Warburg效应”,然而目前关于有氧糖酵解的转录调控机制仍然不够清楚,靶向“Warburg效应”的抗肿瘤药物研发也进展缓慢。辅助转录因子4(Positive Cofactor 4,PC4)是一种功能强大且结构高度保守的核蛋白,广泛存在于酵母(称为Sub1)、哺乳动物和人类(又称为p15)等组织细胞中。除了参与RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase II,RNAPⅡ)介导的基础转录,PC4还可以调控DNA复制、染色质重塑以及DNA修复等分子生物学过程。近年来关于PC4的生物学功能研究逐渐增多,本课题组最早报道了PC4在正常细胞恶性转化后的模型以及肺癌临床标本中异常高表达,且PC4能通过VEGF-C/VEGF-D/VEGFR-3通路促进肺癌淋巴管生成。Qian等研究也发现PC4可以通过调节XLF介导的非同源末端连接,进而影响食管癌的放疗敏感性。虽然已有少量研究报道PC4在肿瘤中的作用,但是PC4在肿瘤发生发展中的分子生物学机制仍然不清楚,尤其在乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌等常见恶性肿瘤中的功能和意义还未被研究报道。本研究首先以常见的乳腺癌为研究样本,在114例乳腺癌临床标本中检测PC4蛋白表达情况,并分析PC4表达水平与患者转移和预后生存的相关性。通过对GSE9893数据库中155例乳腺癌患者进行基因富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)以及体内外实验验证,探究PC4调控乳腺癌的哪些恶性表型。然后,根据GSEA结果的提示,通过检测细胞外酸化率(extracellular acidification rate,ECAR)、葡萄糖摄入、乳酸产生、ATP生成和糖酵解关键蛋白表达,以及染色质免疫共沉淀(chromatin-immunoprecipitation,CHIP)等实验,探究PC4调控乳腺癌恶性表型的机制。最后,我们拓展研究了结直肠癌和前列腺癌这两大常见恶性肿瘤中PC4蛋白的表达情况,并分析PC4表达水平与肿瘤临床病理特征和患者预后的相关性,探索PC4能否成为辅助多种肿瘤早期诊断和预测患者预后的新型分子标志物。研究方法与结果:1、PC4在人乳腺癌标本中异常高表达,并与肿瘤转移和患者预后密切相关为了探究PC4在人乳腺癌临床标本中的表达特点和意义,共收集114例乳腺癌临床标本及其癌旁组织,免疫组化检测后发现PC4蛋白主要表达于细胞核,并且乳腺癌组织的PC4蛋白表达水平远高于癌旁组织,而正常组织中几乎没有PC4蛋白表达。然后,将上述标本中按有无发生转移进行分类,发现有转移的癌组织中PC4蛋白表达水平高于无转移的癌组织。最后,Kaplan-Meier分析结果表明PC4高表达组的患者比PC4低表达组总生存期更短,预后更差。2、体内和体外研究表明PC4可以促进乳腺癌细胞生长和EMT介导的转移为了进一步探究PC4在乳腺癌细胞中的生物学功能,首先将GSE9893数据库中的155例乳腺癌患者以PC4表达量的中位数分为PC4低表达组(n=78)和PC4高表达组(n=77),再通过GSEA分析发现,PC4高表达组的临床标本中有增殖和和上皮-间充质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关基因的富集,提示PC4可能与乳腺癌的生长和转移相关。随后,我们选择了MCF-7和MDA-MB-231两种乳腺癌细胞系,并设计2对PC4干扰序列,采用慢病毒转染构建PC4稳定低表达的乳腺癌细胞系。通过CCK-8检测、集落形成以及裸鼠荷瘤等体内外实验,证明了敲低PC4可以抑制乳腺癌的生长。通过划痕、transwell侵袭实验以及尾静脉注射肿瘤细胞构建肿瘤转移模型等体内外实验,证明了敲低PC4可以抑制乳腺癌的侵袭转移。通过qPCR和western blot检测发现,敲低PC4是通过抑制乳腺癌细胞的EMT过程,即敲低PC4可以增加上皮标志物E-cadherin的表达,并减少间质标志物N-cadherin和Vimentin的表达,进而减弱乳腺癌侵袭转移能力。3、PC4通过促进有氧糖酵解维持乳腺癌的恶性表型为了进一步探究PC4调控乳腺癌细胞恶性表型的机制,对GSE9893数据库中155例乳腺癌患者的GSEA分析发现,PC4高表达组的临床标本中有糖酵解相关基因的富集,提示PC4可能调控了乳腺癌的糖酵解。然后,通过ECAR实验证明了敲低PC4可以抑制乳腺癌细胞的糖酵解水平和糖酵解贮备能力。通过流式检测2-NBDG摄取、试剂盒检测乳酸和ATP含量发现,敲低PC4还可以抑制乳腺癌细胞的葡萄糖摄取、乳酸产生和ATP生成等糖酵解相关过程。western blot检测发现,敲低PC4可以抑制乳腺癌细胞中糖酵解关键酶GLUT1和LDHA的蛋白表达水平。最后,过表达PC4基因可以增强乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,但这些增强的恶性表型都能够被加入的糖酵解抑制剂2-DG所抑制,这也进一步确定了PC4所介导的乳腺癌恶性表型是依赖于糖酵解的。4、PC4促进c-Myc转录表达调控乳腺癌的有氧糖酵解为了进一步探究PC4调控乳腺癌有氧糖酵解的机制,对GSE9893数据库中155例乳腺癌患者的GSEA分析发现,PC4高表达组的临床标本中有Myc相关基因的富集。鉴于c-Myc在糖酵解中的重要作用,我们推测PC4可能通过调节c-Myc,促进乳腺癌的糖酵解。随后,qPCR和western blot检测表明敲低PC4可以抑制乳腺癌细胞c-Myc基因的mRNA和蛋白表达水平。肿瘤代谢和肿瘤表型相关实验也表明,过表达c-Myc可以逆转因敲除PC4所导致的ECAR降低、葡萄糖摄入减少、乳酸和ATP生成减低,可以逆转因敲除PC4所导致的乳腺癌恶性表型(增殖、迁移和侵袭能力)减低。western blot检测也表明过表达c-Myc可以恢复因敲除PC4所导致的糖酵解(GLUT1和LDHA)和EMT表型相关蛋白(E-cadherin和Vimentin)的变化。最后,通过软件预测发现c-Myc启动子区域有PC4蛋白结合位点,随后用CHIP实验证明了PC4能结合至c-Myc启动子区域。5、PC4在结直肠癌细胞和前列腺癌中异常高表达,并与肿瘤分化程度、浸润转移和患者预后密切相关为了探究PC4在肿瘤中的异常高表达是否具有一定普遍性,是否能将PC4蛋白作为辅助多种肿瘤诊断和预后预测的分子标志物,我们选择发病率仅次于肺癌和乳腺癌的结直肠癌和前列腺癌为研究样本。首先,western blot检测人正常肠上皮细胞系CCD841 CoN,以及SW480,SW620,LS174T,HCT116,LOVO和HT29等6种人结直肠癌细胞系中PC4蛋白表达水平发现,PC4在结直肠癌细胞中表达水平高于正常肠上皮细胞。然后,收集93例结直肠癌临床标本及其癌旁组织,免疫组化染色发现PC4蛋白主要定位于细胞核,但也有部分表达于细胞浆,并且结直肠癌组织的PC4蛋白表达水平远高于癌旁组织。收集6对结直肠癌组织和癌旁组织的冰冻样本,通过组织蛋白提取和western blot检测也证实了上述结果。进一步分析发现,低分化和中分化结直肠癌组织的PC4表达水平均高于高分化组织。此外,还发现肠腺癌中的PC4表达水平远高于肠腺瘤,T3/T4期结直肠癌组织的PC4表达水平高于T1/T2期。最后,Kaplan-Meier分析表明PC4高表达组结直肠癌患者的总生存期比PC4低表达组更短,预后更差。通过qPCR、western blot和免疫荧光比较人正常前列腺上皮细胞系RWPE-1,以及LAPC4,C4-2,PC3和DU145等4种人前列腺癌细胞系中PC4表达水平发现,PC4在前列腺癌细胞中表达水平高于正常前列腺上皮细胞,并且雄激素非依赖性前列腺癌(Androgen-independent prostate cancer,AIPC)细胞中PC4表达水平高于雄激素依赖性前列腺癌(Androgen-dependent prostate cancer,ADPC)细胞。然后,收集前列腺癌临床标本及其癌旁组织,免疫组化检测发现前列腺癌组织的PC4蛋白表达水平远高于癌旁组织。进一步分析发现,低分化前列腺癌组织的PC4表达水平高于高分化组织,且发生转移的前列腺癌组织中的PC4蛋白表达水平远高于未发生转移的。此外,Kaplan-Meier分析还发现PC4高表达组结直肠癌患者的总生存期比PC4低表达组更短,预后更差。研究结论:1、本研究首次报道PC4蛋白在人乳腺癌临床样本中异常高表达,并且与肿瘤转移和患者预后密切相关,提示PC4可能成为辅助乳腺癌诊断治疗的新型分子标志物。2、通过GSEA分析和体内外实验发现,PC4通过调控糖酵解而促进乳腺癌的生长和转移。这不仅首次证明了PC4在肿瘤能量代谢重编程中的作用,还丰富了“Warburg效应”的转录调控机制。3、后续机制研究发现,PC4通过直接结合c-Myc的启动子,促进c-Myc及其下游糖酵解相关基因(GLUT1和LDHA)的转录表达,进而调控乳腺癌的有氧糖酵解。这不仅揭示了c-Myc的上游调控机制,靶向PC4还能为c-Myc高表达的肿瘤患者提供新的治疗策略。4、PC4蛋白在结直肠癌和前列腺癌的临床标本中也呈异常高表达,并且与肿瘤的分化程度、浸润转移和患者预后等密切相关。结合本课题组前期在肺癌中的研究结果,提示PC4可能成为辅助多种肿瘤诊断以及预后预测的新型分子标志物。