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背景与目的:中国男性肺癌的发病率和死亡率都为恶性肿瘤之首,严重威胁人类的健康。紫杉醇目前是临床上治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的常见药物,但是长期使用产生的耐药性严重地限制了其临床疗效。SLCO1B3(Solute Carrier Organic Anion Transporter Family,Member 1B3)是一种有机阴离子运输多肽蛋白,位于肝细胞膜上,由转运蛋白SLCO1B3基因编码,(Gene bank:NM-019844)。SLCO1B3同时也在多种癌细胞中存在,是紫杉醇等阴性离子化学抗癌药物转运蛋白。LKB1为常见的抑癌基因,它的底物包括AMPK。研究证实在非小细胞肺癌中,LKB1的突变率高达15-35%。LKB1的突变失活,影响导致AMPK活性下降和m TOR活性升高,从而促进肿瘤的发生和转移。Metformin为临床上抗糖尿病的一线药物,近年来在肿瘤治疗中引起高度重视。它是AMPK的激活剂,在许多条件下,二甲双胍的作用通过AMPK介导的。本研究采用A549和A549-LKB1细胞为模型,研究二甲双胍和紫杉醇转运蛋白SLCO1B3之间的关系。方法:1.采用不同浓度的紫杉醇处理A549和A549-LKB1细胞,计算细胞生长抑制率;采用二甲双胍和紫杉醇联合处理A549细胞,计算活细胞数量,来反应药物对细胞的抑制率,探究AMPK是否增加紫杉醇的抗肿瘤效应。2.采用q-PCR和Western blot方法,从m RNA和蛋白水平检测紫杉醇对SLCO1B3表达的影响。3.二甲双胍处理A549细胞和A549-LKB1细胞,提取总RNA,通过q-PCR检测二甲双胍对SLCO1B3 m RNA水平的影响。4.建立A549细胞紫杉醇耐药株,观察细胞形态变化;通过浓度测试,检测细胞活力,计算耐药指数。5.提取总蛋白和总RNA,Western blot和q-PCR检测A549紫杉醇耐药株SLCO1B3的表达变化。二甲双胍作用于A549紫杉醇耐药株,探索二甲双胍是否能够逆转SLCO1B3表达。结果:1.细胞存活率实验表明,与野生型相比较,高表达LKB1的A549细胞对紫杉醇的敏感性更高,紫杉醇抑制肿瘤细胞生长效率更高(p<0.05 vs对照组)。采用二甲双胍和紫杉醇联合处A549细胞,其细胞生长抑制率高于单用紫杉醇组,进一步提示二甲双胍能够提高紫杉醇的敏感性,增强其抗肿瘤效应。2.采用不同浓度的紫杉醇(2.5,5,10,20,40 n M)处理A549细胞48小时,Western blot和q-PCR检测发现,随着紫杉醇浓度的增加,SLCO1B3蛋白和m RNA表述均受到抑制,且磷酸化ACC的表达也受到抑制;采用10 n M的紫杉醇处理不同时间(0,8,12,24,48,72 h)处理A549细胞,观察到,随着紫杉醇作用时间的延长,SLCO1B3蛋白和m RNA的表达述均受到抑制(p<0.01 vs对照组),p-AMPK表达下降,且呈时间依赖性。3.采用10 m M二甲双胍处理A549和A549-LKB1,提取总RNA,q-PCR检测结果显示,二甲双胍处理组,两株细胞SLCO1B3 m RNA表达均增加(P<0.01 vs对照组)。在二甲双胍的作用下,A549-LKB1细胞的SLCO1B3 m RNA表达高于A549(P<0.01 vs对照组),提示这可能与AMPK有关。4.A549紫杉醇耐药株构建成功,显微镜拍照观察,细胞形态学发生改变,从上皮型细胞发生了类似成纤维的转变,细胞耐药指数RI=2.3。5.Western blot和q-PCR结果显示,与野生型相比较,A549紫杉醇耐药株中SLCO1B3蛋白的表达和m RNA表达水平均下降。采用二甲双胍处理A549紫杉醇耐药株,Western blot结果显示,二甲双胍组SLCOB3蛋白表达水平增加。结论:1二甲双胍/AMPK能够提高A549细胞对紫杉醇敏感性,增强紫杉醇的药物敏感性。2随着紫杉醇作用时间和浓度的增加,SLCO1B3蛋白和m RNA的表达均受到抑制,SLCO1B3能够介导紫杉醇耐药性的发生;且紫杉醇能够抑制AMPK的激活。3二甲双胍/AMPK能够上调SLCO1B3的表达。本研究将为AMPK药物激活剂二甲双胍用于抗肿瘤,或与其他化疗药物联合抗肿瘤提供实验和理论依据。