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猪繁殖呼吸综合征PRRS (Porcine reproductive and respiratory syndrome,又称蓝耳病)是由PRRSV (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus)感染引起的,目前在世界范围内广泛流传,并且造成了感染猪繁殖障碍、免疫力低下、发病率和死亡率较高,给养猪业造成巨大经济损失,并带来肉产品安全及环境安全等隐患。PRRSV感染而导致猪免疫抑制及其免疫机制复杂,至今还没有防治PRRSV的有效药物与疫苗。PRRSV具有极强的宿主偏嗜性,只感染家猪和野猪,也不感染其它动物。目前在猪PRRSV主要感染猪宿主PAM (Porcine Alveolar Macrophage)肺泡巨噬细胞,也从该细胞中鉴定出来了有CD163, CD169(SN, Sialoadhesin)等受体分子。在猪的SN受体具有黏附病毒唾液酸分子,介导病毒感染细胞的能力,受体基因位点直接影响与PRRSV结合力,对PRRSV受体研究是致病机理和抗病机理研究的趋势之一。因此,本研究从PPRSV细胞受体SN基因角度,以受体分子与PRRSV相互作用为重点,分析受体SN基因与PRRSV结合的重要氨基酸位点,研究该位点在与PRRSV结合和在PRRSV物种感染偏嗜性中的作用,探讨受体和PRRSV的相互作用的机理,为抗PRRSV感染的防治药物研制提供分子靶标,为抗病分子育种提供参考。一、利用生物信息学预测与PRRSV结合的SN氨基酸位点:1、将鼠SN中PDB数据库所有SN蛋白模板和唾液酸的配体进行了结构重叠和比对,确定了在6.5A范围内对结合唾液酸最关键的氨基酸；明确了唾液酸分子衍生物都有差异,但是鼠唾液酸分子都有保守的Neu5Ac的母核,而且在不同的PDB(Protein Data Bank)模板中,该母核位置保守和其形成氢键相互作用的氨基酸也是保守的。2、根据猪SN基因cDNA及氨基酸序列,在Signal IP信号肽预测和蛋白结构功能Smart预测的网站上进行预测,参照PDB上鼠SN的模板结构,猪SN信号肽剪接位点可能在第19-20位氨基酸之间。3、利用Smart对SN蛋白的结构和功能进行预测,确定猪SN参与病毒唾液酸结合的功能区域为N末端的150个氨基酸以内的区域。4、利用糖基化预测网站和软件,预测猪pSN的S107, T3,T78等位点,在PRRSV感染的过程中可能发生了糖基化。5、根据猪SN和鼠SN的多序列进行比对和结构重叠的结果,R97,R105氨基酸在PRRSV感染的过程中可能发生侧链方向的改变,而且提供氢键以利于病毒唾液酸的结合。W106,W2氨基酸在结合唾液酸时,因为巨大侧链空间阻碍和方向不变,可能限制PRRSV的唾液酸母核结合SN时的方向。6、利用多序列比对和同源模建及分子动力学优化等,分别构建了猪SN和牛SN的蛋白结构模型；然后与PDB数据库中报道的鼠SN的蛋白结构模型进行了结构比对和重叠；再用Chimera软件构建分子突变体,最后观察猪SN、牛SN蛋白结构的变化。结果表明：猪SN蛋白分子表面形成一个明显的较深的孔洞,而牛的则不明显；将猪SN的S107突变为牛SN的V107时,猪SN的孔洞空间缩小,反之将牛SN的V107突变为猪SN的S107时,牛SN的孔洞空间略有增加,因此预测猪SN的S107在PRRSV结合时可能具有重要作用。7、通过比较分析猪SN的结构,发现猪SN相对于鼠和牛的SN有其特异性,其表面的107位点是特异的亲水氨基酸；在结合病毒唾液酸的过程中,很可能提供了氢键和一个特异的亲水区域以容纳病毒的唾液酸,从而增加了病毒和猪SN的结合能力,这也许是猪个体间存在PRRSV易感性或抗性差异、不同物种间(猪、牛、鼠等)存在PRRSV感染偏嗜性差异的原因之一。此外,猪SN的2,44,45,97,105,106,109等位点的氨基酸,都参与了亲水空间区域的形成。二、利用分子生物学技术分析和验证生物信息预测的PRRSV结合的重要SN氨基酸位点及其作用：1、为了研究生物信息学预测的SN受体氨基酸位点(3、78和107)与PRRSV相互作用,根据猪pSN受体和牛cSN受体(不结合PRRSV唾液酸)序列,利用pEGFP-N1载体和定点突变技术分别构建了猪和牛SN的2个野生型和4个突变体。它们包括2个野生型(pSN-GFP、cSN-GFP)、4个突变体(pSN-S107V-GFP, pSN-T3V-GFP, pSN-T78V-GFP和cSN-V3T-V78T-V107S-GFP)。2、利用pEGFP-N1载体分别构建了GFP和SN融合蛋白的表达载体,并在293T细胞中进行融合表达,利用采用超滤离心技术从细胞培养液中获得了纯度较高的6个SN-GFP融合蛋白(pSN-GFP、cSN-GFP、pSN-S107V-GFP, pSN-T3V-GFP, pSN-T78V-GFP和cSN-V3T-V78T-V107S-GFP),用于在分子水平研究受体SN与PRRSV的结合力的研究。3、在SN-GFP载体的后端加上SN的跨膜片段M,分别构建了6个表达SN-GFP-M载体(pSN-S107V-GFP-M, pSN-T3V-GFP-M, pSN-T78V-GFP-M, cSN-V3T-V78T-V107S-GFP-M, pSN-GFP-M, cSN-GFP-M)和1个对照GFP-M载体,在293T细胞中表达7个SN-GFP-M融合蛋白,用于在细胞水平分析受体SN与PRRSV的相互作用的分析。4、利用WB (Western Blot)技术证明和鉴定了本研究所表达蛋白分别为6个SN-GFP融合蛋白、7个SN-GFP-M融合蛋白。5、分别利用FAR-WB (FAR-Western Blot)技术、ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)技术分析了SN-GFP蛋白和PRRSV的结合活性。分别分析了2个SN野生型融合蛋白(pSN-GFP、cSN-GFP)和4个突变体融合蛋白(pSN-S107V-GFP, pSN-T3V-GFP, pSN-T78V-GFP和cSN-V3T-V78T-V107S-GFP)与PRRSV的结合力,结果表明：猪野生型pSN-GFP蛋白的结合高于其它5种蛋白的结合,发生突变后的猪SN蛋白(pSN-S107V-GFP, pSN-T3V-GFP, pSN-T78V-GFP)的结合力都降低,特别是pSN-S107V-GFP蛋白结合力显著的下降；而牛野生型cSN-GFP蛋白不能与PRRSV结合,但发生突变(cSN-V3T-V78T-V107S-GFP)蛋白能与少量PRRSV结合。6、利用免疫细胞荧光技术,分析了SN-GFP-M蛋白和PRRSV的结合活性。在293T细胞中分别表达了6个带SN的跨膜片段M的SN-GFP-M和1个对照GFP-M蛋白,利用免疫细胞荧光技术,分别探讨了猪和牛SN野生型融合蛋白、3个猪突变体融合蛋白、1个牛突变体融合蛋白、1个对照GFP-M蛋白与PRRSV的结合力,试验结果与利用FAR-WB技术分析的结果相类似。7、以上所有结果表明猪SN基因中第T3、T78和S107氨基酸在与PRRSV结合中具有一定的作用,特别是S107位具有重要的作用。8、猪pSN野生型具有强的PRRSV结合能力,本试验将猪相应氨基酸替换成牛的氨基酸,猪pSN突变型pSN-T78V、pSN-T3V降低了结合PRRSV能力,pSN-S107V显著地降低了结合能力。而将牛SN进行cSN-V107S突变,将牛替换成了猪的氨基酸,生物信息分析显示可以恢复部分的结合PRRSV的能力；并且牛的突变体cSN-V3T-V78T-V107S-GFP在一定程度上也能与PRRSV结合,因此推测：这些位点在不同猪个体对PRRSV敏感性或抗性存在差异、不同物种对PRRSV感染偏嗜性中具有一定的作用。