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目的:本研究主要通过动物体内实验和细胞体外实验,来观察金银花水提物(Lonicerae Japonicae Flos aqueous extract,FL)及其绿原酸(Chlorogenic acid,CGA)对糖尿病视网膜病(Diabetic retinopathy,DR)的改善作用,并从调控视网膜血管新生和炎性损伤的角度深入研究金银花及其CGA改善增殖性糖尿病视网膜病(Proliferative DR,PDR)和非增殖性糖尿病视网膜病(Non-proliferative DR,NPDR)药效活性的机理。通过本课题的研究,为中药金银花和CGA在DR中的应用提供一定的实验证据。方法:1.采用STZ(Streptozotocin,STZ)诱导小鼠Ⅰ型糖尿病,并在此基础上诱发糖尿病视网膜病变,建立DR的实验动物模型,包括PDR和NPDR。在此基础上,给予药物FL和CGA进行干预。2.运用视网膜血管CD31(Cluster of differentiation 31)免疫荧光染色和H&E(Hematoxylin-eosin)视网膜染色观察动物视网膜组织中的血管新生情况。3.通过检测视网膜组织中伊文思蓝(Evans blue)的渗漏来检测血-视网膜屏障的破坏情况。4.采用Real-Time PCR实验检测视网膜组织中炎性相关基因的表达。5.采用蛋白电泳Western-Blot实验检测视网膜组织中促血管新生、炎性相关蛋白的表达水平。6.采用ELISA实验检测动物血清中VEGF(Vascular endothelial growth,VEGF)的含量,以及动物血清中IL-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、IL-6(Interleukin-6,IL-6)、TNFα(Tumor necrosis factor-α,TNFα)的含量。7.采用高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)检测分析FL中CGA、咖啡酸(Caffeic acid,CA)和木犀草素(Luteolin)这三种成分的含量。8.用MTT法检测FL及其活性单体CGA、CA、Luteolin对RF/6A细胞细胞存活率的影响,并检测了FL对VEGF诱导的RF/6A细胞增殖的影响。9.接下来用管腔实验又检测了CGA、CA、Luteolin对VEGF诱导的RF/6A细胞管腔形成的影响,初步确定FL中体外抗血管新生活性的药效物质基础为其所含化合物CGA。此外还检测了CGA对VEGF诱导的HREC细胞管腔形成及迁移的影响,深入探究CGA的体外抑制血管新生活性的机制。10.神经小胶质细胞BV-2先加CGA(0.625、2.5μM)处理后,再加入高浓度葡萄糖(25 mM)。采用蛋白电泳和Real-Time PCR实验检测CGA对调控血管新生相关HIF-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)-VEGF-VEGFR2信号通路蛋白的影响。11.BV-2细胞先加CGA(0.625、2.5μM)处理后,再加入高浓度葡萄糖(25 mM)。采用蛋白电泳实验检测CGA对调控炎性损伤相关NF?B(Nuclear factor kappa B,NF?B)、Egr-1(Early growth response 1,Egr-1)转录激活的影响。结果:1.STZ诱导PDR小鼠5月龄时,糖尿病小鼠视网膜内血管新生现象明显。fl(100、200mg/kg)可以明显降低pdr小鼠视网膜内增加的血管数量,同时降低pdr小鼠血清中vegf的含量。体外视网膜内皮细胞rf/6a上的实验发现,fl本身对rf/6a没有明显的细胞毒性,但是可以剂量依赖性的抑制vegf诱导的rf/6a细胞增殖。内皮细胞管腔形成的实验结果表明fl可以抑制vegf诱导的rf/6a细胞的管腔形成。2.fl中的成分cga、ca和luteolin本身对rf/6a细胞没有明显细胞毒性,但是均可以抑制vegf诱导的rf/6a细胞管腔形成,其中cga效果最佳,最低有效浓度为0.625um。hplc分析结果表明fl中cga的含量为14.73%;ca的含量为0.17%;luteolin的含量为0.061%。cga是fl中含量最高的成分,含量远远大于ca和luteolin。3.stz诱导pdr的体内动物实验结果表明cga(1,10mg/kg)可以明显降低stz诱导pdr小鼠视网膜内增加的血管数量,同时降低pdr小鼠血清中vegf的含量。cga本身对人视网膜内皮细胞hrec没有明显细胞毒性,但是可以抑制vegf诱导的hrec细胞增殖、管腔形成以及细胞迁移。4.进一步研究cga抑制视网膜血管新生的机理发现:高浓度葡萄糖(25mm)可以诱导神经小胶质细胞bv-2中hif-1α的转核激活,进而增加vegf的蛋白表达水平,而cga(0.625、1.25um)能够显著的抑制上述过程。5.stz诱导npdr动物实验中,evansblue渗漏检测实验显示,fl(50、100mg/kg)及cga(1、5mg/kg)均能够明显改善stz诱导的小鼠糖尿病视网膜病引起的血-视网膜屏障的破坏,这些作用都呈现剂量依赖性。6.进一步研究fl改善npdr的机理发现:fl(50、100mg/kg)能够明显降低npdr小鼠视网膜组织中升高的小胶质细胞/巨噬细胞特异性蛋白(ionizedcalciumbindingadaptermolecule1,iba1)的表达;fl可以抑制stz诱导糖尿病小鼠视网膜组织中核因子?b(nuclearfactor?b,nf?b)p65亚单位的转核激活;抑制视网膜组织中kappab抑制剂(inhibitorof?b,i?b)、抑制性?b激酶(inhibitorofnuclearfactor?bkinase,ikk)、p65的磷酸化激活。同时fl还能降低npdr小鼠血清中升高的il-1?、il-6的表达。7.深入研究cga改善npdr的机理发现:cga能够抑制高浓度葡萄糖(25mm)刺激的bv-2细胞内nf?b信号通路的激活,包括抑制nf?bp65、i?b、ikk的磷酸化激活,抑制nf?bp65的转核,抑制炎性因子il-6、tnfα的基因表达;cga还能够抑制高浓度葡萄糖(25mm)刺激的bv-2细胞内egr-1的转核。结论:1.fl及cga通过降低促血管新生因子vegf的表达,抑制了视网膜血管新生,从而改善了pdr的进程。深入研究cga改善pdr的机理发现它可以通过抑制视神经小胶质细胞中hif-1?的转核,抑制了神经小胶质细胞vegf的旁分泌表达,从而达到抑制视网膜血管新生,改善pdr的药效活性。2.fl及cga通过抑制视网膜炎性损伤,缓解血-视网膜屏障的损坏,达到改善npdr的药效活性。深入研究cga改善npdr的机理发现它可以抑制神经小胶质细胞的活化,进一步通过抑制神经小胶质细胞中炎性相关nfкb和egr-1信号通路的激活,降低了炎性因子的水平,进而减缓视网膜炎性损伤,缓解了NPDR的进程。