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[目的]急性髓系白血病作为一种高度异质性的疾病,诱导失败和耐药复发是其治疗失败的主要原因。而白血病干细胞是急性髓系白血病发生、耐药和复发的根源,针对白血病干细胞的靶向治疗更有可能根治白血病。IL-3受体介导的信号传递是促进急性髓系白血病细胞增殖的原因之一；IL-3受体α链/CD123更是急性髓系白血病干细胞的标志之一,而正常造血干细胞表面表达水平低下。因此,制备能靶向杀伤白血病干细胞的抗CD123的单克隆拮抗抗体,可能具有潜在的治疗价值。[方法]第一部分：克隆IL3RA胞外区与人IgGFc重组,构建两种真核表达载体,即pG4Fc-3.3-hIL3RA SP+ECD和pYDll-hIL3RAECD,瞬时转染HEK-293F细胞,选择表达效率最佳的载体表达、纯化并鉴定IL3RA ECD/Fc融合蛋白,作为免疫原。同时,我们定向克隆IL3RA编码区构建另外两种真核表达载体,即hIL3RA CDS-pEGFP-N1和pcDNA3.1(+)-IL3RA CDS,前者用于制备稳定表达CD123的细胞株以供后续检测和筛选抗体,后者将作为另一种免疫方式免疫小鼠；为克服质粒免疫动物后血清抗体效价低的缺点,我们还重组包装了能表达CD123的腺病毒Ad-IL3RA,供质粒免疫后的加强免疫使用。第二部分：利用前面构建的真核表达载体hIL3RA CDS-pEGFP-Nl脂质体转染CHO细胞,经过流式分选、G418筛选和流式、Elisa和Western blot鉴定CD123的表达水平,获得能稳定高表达CD123的细胞株,供制备抗体时筛选抗体用。同时,以IL3RAECD/Fc融合蛋白、表达IL3RA的急性红白血痫TF-1细胞株和前述构建的重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-IL3RA CDS质粒三种方式进行免疫,Elisa筛选血清抗体效价高的Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/O细胞融合,经过Elisa和间接流式挑选阳性孔,再进行数轮有限稀释和筛选,挑选出能分泌抗CD123单克隆抗体的杂交瘤细胞株,供后续功能试验用。第三部分：建立IL-3增殖拮抗实验和急性白血病免疫缺陷NOD/SCID小鼠异种移植模型,分别检测这11株抗体竞争性拮抗IL-3/IL3RA交联及IL-3的促增殖效应,介导ADCC效应抑制白血病CD34+CD38细胞归巢和CD45+细胞植入,降低肿瘤负荷并延长生存期的靶向治疗效应。[结果]除利用TF-1细胞免疫未能获得抗体以外,我们利用制备的重组蛋白和质粒两种抗原免疫,各获得了3株和8株能分泌抗CD123抗体的杂交瘤细胞株,并经Elisa和间接流式证实杂交瘤株所分泌抗体与IL3RA ECD/Fc融合蛋白、TF-1和8G9细胞表面CD123的亲和力,且质粒免疫获得的1株抗体在后续的IL-3增殖拮抗实验中被证实能阻断细胞膜表面IL-3/IL3RA的交联以及IL-3的促增殖效应,表明是一株拮抗抗体。为进一步验证治疗性抗体抗肿瘤功能,还建立并验证了急性白血病免疫缺陷NOD/SCID小鼠模型。[结论]利用质粒免疫、腺病毒加强的方式制备抗体效率最高,更易获得有功能的治疗性抗体。共获得11株能分泌抗CD123单克隆抗体的杂交瘤细胞株,通过IL-3增殖拮抗实验,从中筛选出1株能竞争性拮抗IL-3/IL3RA的交联及IL-3的促增殖效应的拮抗抗体5A2,尚需利用建立的模型验证5A2是否介导ADCC效应,抑制白血病CD34+CD38-细胞归巢和CD45+细胞植入,降低肿瘤负荷并延长生存期。