幽门螺杆菌感应蛋白CrdS的原核表达及其在酸适应调控中的作用

来源 :重庆医科大学 重庆医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:nj_wpp1
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目的:原核表达并纯化幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)CrdRS信号传导系统中的感应蛋白CrdS,并进行生物信息学分析,通过体外酸环境培养实验,探讨其在H.pylori酸适应调控中的作用。方法:提取H.pylori26695标准株全基因组DNA,以此为模版,PCR扩增编码CrdS蛋白的基因hp1364;构建重组克隆质粒pUCm-T-hp1364和原核表达质粒pQE30-hp1364,经PCR、双酶切和测序鉴定后,转化大肠埃希菌XL1blue,IPTG诱导表达目标蛋白;通过SDS-PAGE分析,Western blot鉴定表达蛋白,并对CrdS蛋白进行生物信息学分析。用纯化后的重组蛋白CrdS免疫家兔获得其免疫血清。通过体外在不同pH值的培养基中加入含抗CrdS的免疫血清培养H.pylori实验,初步探讨CrdS在H.pylori酸适应调控中的作用。结果:以提取的H.pylori基因组DNA为模板,PCR扩增hp1364基因,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析,可见在1200bp处有一明显条带,与hp1364基因的分子量大小相符。重组克隆质粒pUCm-T-hp1364和原核表达质粒pQE30-hp1364经BamHⅠ/HindIII双酶切后,琼脂糖凝胶电泳分析可见约1200bp处有明显条带;测序后,经NCBI BLAST在线比对所测序列与hp1364基因序列完全相符。诱导表达的目标蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子量约为46kDa,主要以包涵体形式存在。Western blot鉴定表明表达蛋白确为目标蛋白。生物信息学分析CrdS的核酸和氨基酸序列与其它H.pylori菌株比较具有极高的同源性,表面有许多亲水性区域,含有多种容易被磷酸化的氨基酸。免疫家兔后获得该重组蛋白的免疫血清,H.pylori酸环境培养实验表明CrdS能够影响H.pylori的生长。结论:成功构建了重组克隆质粒pUCm-T-hp1364和原核表达质粒pQE30-hp1364,原核表达了H.pylori CrdS蛋白。初步证明该蛋白参与了H.pylori酸适应调控,为深入探讨H.pylori酸适应调控机制和新的抗H.pylori感染的途径提供了实验材料和依据。
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