研究背景及目的:　　 Tim-3(Tcellimmunoglobulindomainandmucindomain-containingmolecule-3)是2001年新发现的免疫调节分子，在免疫调节中发挥重要作用。作为Th1细胞表面标记分子，Tim-3与其配体galectin-9结合后负向调控Th1细胞功能，并诱导Th1细胞凋亡。新近研究发现Tim-3不仅特异性表达于极化终木期Th1细胞，而且在多种固有免疫细胞，包括NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞上有较高水平表达。Tim-3与其配体相互作用，在不同固有免疫细胞介导不同的免疫调节作用，深入阐明Tim-3通路对固有免疫的调节作用及其机制，对于阐明免疫相关疾病发病机制、发现新的治疗靶点具有重要意义。　　 作为重要的固有免疫细胞，巨噬细胞是机体抗感染的第一道防线，参与多种免疫相关疾病。巨噬细胞具有很强的可塑性，在不同微环境中可以极化为两种不同的亚群:经典活化型巨噬细胞(M1)和替代活化型巨噬细胞(M2)。M1和M2型巨噬细胞在炎症和肿瘤发生中发挥不用作用。众多研究表明，肿瘤微环境中存在大量巨噬细胞（肿瘤相关巨噬细胞，Tumor-associatedmacrophages，TAMs），近年研究证实TAMs主要为M2型巨噬细胞，能够通过影响血管生成、免疫抑制、侵袭和转移等多种机制促进肿瘤生长。2007年Science报道，Tim-3组成性高表达于巨噬细胞，并通过NF-kB通路促进巨噬细胞炎症反应。然而Tim-3是否参与调节巨噬细胞极化，进而影响TAMs功能并参与肿瘤发生，迄今尚未见报道。本研究利用临床标本及体内外实验研究Tim-3存M1/M2型巨噬细胞极化及TAMs功能和肝癌发生中的作用，为调节抗肿瘤免疫提供新思路。　　 方法:　　 1Tim-3在M1/M2型巨噬细胞中的表达及其对巨噬细胞极化的调节作用　　 1.1以腹腔居留巨噬细胞与小鼠骨髓细胞诱导M1/M2巨噬细胞，并检测Tim-3表达　　 收集3-6只小鼠的腹腔居留巨噬细胞接种于24孔培养板，每孔1×106个细胞，24h后分别加入终浓度100ng/mL及10ng/mL的LPS或IL-4刺激24h（PBS处理组为对照），诱导M1、M2型巨噬细胞。收集上述诱导模型的细胞和上清，冻存备用。ELISA检测IL-12及IL-10表达;RT-PCR检测M1、M2型巨噬细胞相关分子，验证M1、M2细胞是否诱导成功，并流式检测各组细胞Tim-3的表达。　　 新鲜分离的骨髓细胞接种于24孔培养板，每孔1×106个细胞。分别用20ng/mL的GM-CSF或100ng/mL的M-CSF诱导5d后，再以10ng/mL的LPS刺激24h，分别收集细胞及上清，同上验证M1、M2细胞表型，并流式检测各组细胞Tim-3表达。　　 1.2体外干扰实验研究Tim-3对M1/M2巨噬细胞极化的影响　　 设计并合成针对鼠Tim-3的siRNAoligo及无关序列，脂质体转染淀粉诱导的腹腔巨噬细胞，RT-PCR、westernblot(WB)检测Tim-3表达，验证干扰效果。脂质体转染上述siRNA及无关序列至腹腔居留巨噬细胞或GM-CSF/M-CSF诱导60h的小鼠骨髓巨噬细胞，48h后，分别加入LPS或IL-4继续诱导M1/M2型巨噬细胞，24h后收上清，ELISA检测M1/M2的标志性细胞因子IL-12及IL-10。　　 2Tim-3调节巨噬细胞极化对肝癌细胞生长的影响　　 2.1Tim-3在原发性肝癌患者外周血及肝癌浸润CD14+细胞上的表达　　 收集24例原发性肝细胞肝癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)患者及30例健康志愿者新鲜外周肝素抗凝血。收集4例原发性肝癌患者癌组织和对应癌旁组织，剪碎，胶原酶消化3～6h后，200目不锈钢网上轻轻研磨，收集单细胞悬液。用Ficoll淋巴细胞分离液分离肝癌组织中浸润淋巴细胞。上述细胞同时标染CD14、Tim-3和相应荧光同型对照抗体，流式检测CD14+细胞上Tim-3的表达。　　 2.2共培养实验研究肝癌细胞介导的巨噬细胞极化及Tim-3表达调控　　 将淀粉诱导的小鼠腹腔巨噬细胞与小鼠肝癌细胞系H22以1∶4的比例接种于24孔板混合培养，分别在12h、24h、48h后洗去悬浮生长的H22，收集贴壁生长的巨噬细胞，流式检测Tim-3的表达及M1、M2巨噬细胞表型。　　 2.3阻断Tim-3对肝癌细胞介导巨噬细胞极化的影响　　 新鲜分离的小鼠腹腔巨噬细胞以5×104个/mL接种于24孔板（500mL/孔）。待细胞贴壁后用终浓度为5μg/mL的Tim-3阻断性抗体（IgG为对照）预处理1h后，加入2×105的H22细胞共培养，48h后收腹腔巨噬，流式检测M1标志性细胞因子IL-12的表达。　　 2.4动物实验研究Tim-3介导的巨噬细胞极化对肝癌细胞生长的影响　　 6至8周龄的雄性BALB/c小鼠，后肢内侧皮下注射1×106小鼠肝癌细胞H22，建立小鼠肝癌模型。两周后取瘤体，胶原酶消化，Percoll细胞分离液分离瘤体浸润淋巴细胞。同时，分离对应小鼠脾细胞。上述细胞分别标染CD11b、Tim-3和相应荧光同型对照抗体，流式检测CD11b+细胞Tim-3的表达。　　 M-CSF诱导骨髓细胞60h后转染oligo干扰Tim-3，无关序列转染组为对照。继续诱导48h后，与H22以1∶3比例混合，皮下注射BALB/c成瘤。定期测量瘤体大小，计算肿瘤生长曲线。注射12天后处死动物，称瘤重。　　 结果:　　 1体外实验结果表明，Tim-3高表达于M2型巨噬细胞，并促进M2型巨噬细胞极化　　 1.1M2型巨噬细胞的Tim-3表达水平显著高于M1型巨噬细胞　　 为研究Tim-3在不同巨噬细胞亚群中的表达，分别利用腹腔居留巨噬细胞及骨髓细胞诱导M1/M2型巨噬细胞。ELISA检测结果显示，LPS诱导的腹腔居留巨噬细胞及GM-CSF诱导的骨髓细胞均分泌高水平IL-12（235.01±4.86pg/mL，542.85±5.98pg/mL）及较低水平的IL-10(32.54±3.10pg/mL，87.64±6.26pg/mL);而IL-4刺激的腹腔巨噬细胞及M-CSF刺激的骨髓细胞分泌高水平IL-10(413.49±3.65pg/mL，759.63±5.38pg/mL)和较低水平的IL-12(36.74±3.05pg/mL，186.17±3.10pg/mL)，提示，M1/M2型巨噬细胞诱导成功。RT-PCR检测M1/M2巨噬细胞相关标记分子，进一步证明模型诱导成功。流式细胞术检测不同巨噬细胞Tim-3表达，结果显示，M2型巨噬细胞的Tim-3表达水平显著高于M1型巨噬细胞（腹腔巨噬细胞52.27％±7.02％vs35.53％±1.76％，p＜0.05;骨髓细胞60.10％±3.05％vs98.03％±1.56％,p＜0.01）。　　 1.2抑制Tim3表达有效促进M1型巨噬细胞极化，抑制M2型巨噬细胞极化　　 为进一步研究Tim-3在巨噬细胞极化中的作用，设计针对Tim-3的siRNA，脂质体转染巨噬细胞，RT-PCR和WB结果表明siRNA能有效抑制Tim-3表达。收集腹腔居留巨噬细胞及骨髓细胞，脂质体转染针对Tim-3的siRNA后继续诱导M1/M2型巨噬细胞。ELISA结果表明，与对照组相比，Tim-3siRNA转染组LPS诱导的腹腔居留巨噬细胞及GM-CSF诱导的骨髓细胞分泌IL-12水平显著升高（腹腔居留巨噬细胞:250.45±24.60pg/mLvs.587.41±20.63pg/mL，p＜0.01;骨髓细胞:423.81±30.82pg/mLvs952.99±177.6pg/mL，p＜0.05）;与此相符，与对照组相比，Tim-3siRNA转染组IL-4刺激的腹腔居留巨噬细胞及M-CSF诱导的骨髓细胞分泌IL-10水平显著降低（腹腔居留巨噬细胞:350.37±11.77pg/mLvs136.91±5.66pg/mL，p＜0.01;骨髓细胞:792.43±68.51pg/mLvs318.74±56.51pg/mL，p＜0.05)。提示，抑制Tim-3表达有效促进M1型巨噬细胞极化，抑制M2型巨噬细胞极化。　　 2Tim-3促进巨噬细胞M2型极化抑制肝癌生长　　 文献报道，多种肿瘤包括肝癌中的肿瘤相关巨噬细胞表现为M2型，并与预后不良相关，阐明肝癌微环境对巨噬细胞极化的调节具有重要意义。我们第一部分的研究结果提示Tim-3参与调节巨噬细胞M1/M2极化，在第二部分中我们重点研究Tim-3对肝癌TAMs极化中的作用及其在肝癌中的意义。　　 2.1原发性肝癌患者外周血及肿瘤内CD14+细胞Tim-3表达显著升高　　 为研究Tim-3在肝癌TAMs中的作用，首先收集肝癌患者外周血及肝癌组织，流式细胞术检测Tim-3表达。结果显示，HCC患者外周血CD14+细胞上Tim-3的表达显著高于健康志愿者(P＜0.01);与癌旁组织巨噬细胞相比，肝癌组织内TAMs中Tim-3的表达水平明显升高(P＜0.05)。提示，Tim-3参与肝癌TAMs的极化。　　 2.2肝癌细胞体外共培养可促进M2型巨噬细胞极化并上调Tim-3的表达　　 进一步利用体外共培养体系研究Tim-3在肝癌TAMs极化中的作用，将淀粉诱导的小鼠腹腔巨噬细胞与H22以1∶4的比例共培养，不同时间点检测Tim-3的表达，流式结果显示，随着与H22共培养时间的延长，腹腔巨噬细胞上Tim-3的表达呈上升趋势，RT-PCR结果显示巨噬细胞向M2型极化，进一步提示Tim-3参与肝癌TAMs形成。　　 2.3阻断Tim-3可显著减弱肝癌细胞介导的M2型巨噬细胞极化　　 为探讨Tim-3对肝癌细胞介导巨噬细胞极化的影响，共培养体系中用特异性单克隆抗体阻断Tim-3。流式结果显示，阻断Tim-3后，共培养中巨噬细胞分泌IL-12的能力增强（30.10％±1.84％vs49.80％±1.70％，p＜0.05）。提示，阻断Tim-3可显著减弱肝癌细胞对M2型巨噬细胞的极化作用。　　 2.4荷瘤小鼠体内巨噬细胞Tim-3表达显著升高，干扰Tim-3后的M2可明显抑制小鼠体内肿瘤的生长　　 为进一步研究体内Tim-3介导的巨噬细胞极化在肿瘤中的作用，首先利用H22皮下注射建立荷瘤鼠模型，两周后最大瘤体直径可达1cm。流式结果显示小鼠瘤体浸润CD14+细胞Tim-3表达水平显著高于荷瘤小鼠脾CD14+细胞(P＜0.001)，与体外结果一致。进一步将转染Tim-3siRNA的M2巨噬细胞与H22混合后皮下注射建立荷瘤鼠模型，无关对照序列NC转染组M2与H22的混合注射为对照。肿瘤生长曲线及瘤重分析结果显示，Tim-3干扰组瘤体的大小和重量显著低于NC对照组，提示，抑制Tim-3后的M2可明显抑制肿瘤的生长。　　 结论:　　 Tim-3高表达于腹腔巨噬细胞和骨髓细胞诱导的M2型巨噬细胞，并促进M2型巨噬细胞极化;原发性肝癌患者外周血及肿瘤内CD14+细胞Tim-3表达显著升高;Tim-3在肝癌细胞介导的M2型巨噬细胞极化中发挥重要作用;抑制M2型巨噬细胞中Tim-3表达可明显抑制小鼠体内肝癌细胞的生长。　　 创新性和意义　　 本研究首次证明了Tim-3调节巨噬细胞极化的作用及其对肝癌细胞生长的影响，研究结果不仅有助于阐明Tim-3对固有免疫的调节作用，并且为原发性肝细胞肝癌的肿瘤免疫治疗提供了新思路和新靶点.