随着现代医药科技的发展,人类寿命不断延长,世界人口步入老龄化状态。与此同时,老年人用药的安全性问题也越来越突出,需要引起关注。这一安全性问题主要来源于老年人细胞和器官生理机能的老化带来的药物体内处置变化,以及老年人常合并使用多种药物导致的药物相互作用。但由于药物性质的差异,衰老带来的药动学影响并不总是能很好地被预测。另外,药物的药效作用或毒性与其靶标部位的浓度更具有相关性,提示我们应该关注靶标部位的药物浓度变化。因此,研究老年因素导致药物药动学的变化及机制将更科学地指导老年人群临床个性化用药。阿尔茨海默症是一种年龄相关的神经退行性疾病,目前没有药物能够治愈该疾病,只能改善认知功能,乙酰胆碱酯酶抑制剂为临床首选药物。老年人群使用该类药物时常引起胃肠道、心脏系统、神经系统等不良反应,且70%以上是严重不良反应,阻碍了老年病人持续使用该药物和获得症状改善。氟诺哌齐是由上海药物研究所研发的一种新型选择性乙酰胆碱酯酶抑制剂,相比一线药物多奈哌齐,其对乙酰胆碱酯酶具有更高的选择性和抑制作用,使其有望在临床上具有更好的疗效和安全性。本文以氟诺哌齐为研究对象,采用多种研究手段,从代谢、系统药动学、脑分布等多个角度系统地阐述了氟诺哌齐人体处置过程以及老年因素对其药动学的影响和机制,为氟诺哌齐在老年人群用药提供指导和建议。主要结果总结如下:1.氟诺哌齐的人体代谢特征和代谢酶表型氟诺哌齐口服吸收后,在人体内发生广泛代谢。使用UPLC-UV/Q-TOF高分辨质谱从血浆、尿、粪样品中分别鉴定出6、8和6种代谢产物。代谢途径包括N-氧化（M11）、N-去邻氟苄基（M1）、O-去甲基（M2）、O-去甲基并单氧化（M3）、双去甲基（M5）、O-去甲基并葡萄糖醛酸结合（M9）、单氧化并葡萄糖醛酸结合（M10）、O-去甲基并N-去邻氟苄基（M12）、N-去邻氟苄基并氢化（M13）、氢化（M14）、单氧化并加氢（M15）、葡萄糖醛酸结合（M16）。其中主要代谢产物M1和M11的结构经化学合成对照品分别确证为N-去邻氟苄基氟诺哌齐和顺式-N-氧化氟诺哌齐,这也是氟诺哌齐在人肝微粒体生成的主要代谢产物（占79.3%）。代谢酶表型鉴定显示,CYP3A4和CYP3A5为介导氟诺哌齐氧化代谢的主要代谢酶,对氟诺哌齐的代谢贡献率占64%,其次为CYP2C8,CYP2C9和CYP2D6。在对代谢物M11的结构表征时,发现氟诺哌齐在体内外发生氮氧化具有不同的立体选择性。体内的氮氧化物构型为顺式,而在体外化学合成却倾向于反式构型。为了解释这一现象,本文开展了分子对接实验,结果显示,在CYP3A酶分子催化口袋中,氟诺哌齐顺式氧化时分子结构中的N原子与催化中心血红素铁原子距离比反式氧化更近,倾向于顺式加氧。而在化学反应催化条件下,反式构型的空间位阻更小,因而易于反式加氧。另外,发现氮氧化物M11在人新鲜全血中易被还原为原形,提示M11可以充当药物储库,应关注其体内处置过程。2.老年因素对氟诺哌齐及其代谢物的药动学影响及机制为了评估老年因素对氟诺哌齐人体药动学的影响,本文建立了快速灵敏可靠的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析方法同时测定了老年（62-73岁）和年轻（24-39岁）受试者口服氟诺哌齐后血浆中原形、N-氧化代谢物M11和N-去邻氟苄基代谢物M1浓度。老年和年轻受试者口服氟诺哌齐后,体内达峰时间均在1 h左右,没有明显差异,提示其肠道吸收迅速,且吸收速度没有受到年龄因素的影响。与年轻受试者相比,氟诺哌齐在老年受试者系统暴露量(AUC0-t)增加了54%（91.0±27.0h*ng/m L vs 59.2±7.95 h*ng/m L,p＜0.01）,血浆消除半衰期延长1.41倍（74.2±34.1 h vs 30.8±5.18 h,p＜0.001）,表观分布容积增加40%（3600±961 L vs 2570±239 L,p＜0.01）,清除率显著降低44.7%（38.8±15.6 L/h vs 59.4±11.8 L/h,p＜0.05）,这些提示氟诺哌齐在老年人体内清除减慢,存在蓄积风险。血浆中主要代谢物M1和M11在年轻受试者血浆暴露量分别为原形药物的27.2%和15.4%。这一比例在老年受试者体内降低为18.6%和10.2%,说明代谢生成受到影响。此外,氟诺哌齐、代谢物M1和M11与人血浆蛋白结合率在两组人群无显著性差异,分别为98.9%±0.133%、30.0%±3.55%和60.3%±1.29%,说明血浆游离药物浓度的变化与总浓度的变化一致,即老年人群氟诺哌齐的游离药物浓度也高于年轻人,提示氟诺哌齐在老年人群产生药效的剂量可能低于年轻人群。为了阐明老年人群药动学变化的机制,选用了自然衰老的老年大鼠（23-26月龄）与年轻大鼠（2-5月龄）开展进一步的研究。选择大鼠作为研究种属的原因包括以下几点考虑。氟诺哌齐在大鼠体内的代谢物谱与人相近,且均主要经CYP3A介导代谢。大鼠灌胃给药后,表现出人体相似的药动学变化特征,即氟诺哌齐在老年大鼠的血浆暴露量AUC0-t相比年轻大鼠增加123%（214±72.7h*ng/m L vs 96.0±44.1 h*ng/m L,p＜0.05）、半衰期延长1.54倍（9.23±1.40 h vs6.01±1.08 h,p＜0.05）,Cmax有增加趋势无显著性差异,达峰时间没有差异。代谢物M1和M11血浆暴露量占原形暴露量的比例在老年大鼠降低。首先采用大鼠静脉给药,评估了肠道吸收对因年龄因素导致药动学变动的影响。尾静脉给予0.5 mg/kg氟诺哌齐后,药动学变化趋势与灌胃给药相似,与年轻大鼠相比,氟诺哌齐在老年大鼠血浆暴露量增加81%、半衰期延长1.17倍,代谢物M1和M11占原形血浆暴露量降低。氟诺哌齐的口服生物利用度在两组大鼠没有显著差异,提示吸收过程对老年大鼠药动学变化产生影响不显著。此外,静脉给药还发现,氟诺哌齐在老年大鼠的血浆清除率是年轻大鼠的46.8%,说明其在老年大鼠清除减慢。氟诺哌齐在老年和年轻两组大鼠的平均肾清除率分别为18.8 m L/h/kg和29.2 m L/h/kg,不到血浆清除率2%。进一步的排泄实验结果显示,氟诺哌齐主要经代谢清除,尿粪中原形药物的回收率不超过3%。体外代谢研究表明氟诺哌齐在大鼠肝脏代谢的内在清除率为肠道的50倍以上,人肝脏和肠道代谢清除率差异也大于8倍。说明氟诺哌齐主要经肝脏代谢清除,这也提示血浆清除率的降低主要是由肝代谢清除降低所致。为了进一步阐明老年因素对氟诺哌齐代谢清除的影响,开展了排泄试验。氟诺哌齐在人和大鼠体内均主要以代谢物形式自体内清除。其中,代谢物M1和M11为主要排泄形式,占年轻大鼠给药剂量的44%以上,但在老年大鼠其回收率显著降低（28.5%）,说明老年因素减少了M1和M11体内生成量。但原形的回收率在两组大鼠间未见统计学差异。为解释此现象,本文对尿粪中其他代谢产物进行了半定量分析,发现在老年大鼠体内与单氧化相关的代谢产物（M6-1～M6-3、M7）的回收率均降低,而与O-去甲基代谢相关的部分代谢产物（M2-1、M2-2、M3、M9）回收率略有增加。老年因素主要影响了氟诺哌齐的N-去烷基和单氧化相关代谢过程,而其他代谢途径发生了代偿代谢。这也提示老年大鼠肝脏某一/些代谢酶的活性（内在清除率）发生了改变。肝微粒体的酶促动力学研究结果也进一步证明,氟诺哌齐在老年大鼠肝微粒体的内在清除率仅是年轻大鼠的47.4%。老年大鼠肝微粒体代谢生成M1和M11的速率也显著降低。为了进一步确定哪些代谢酶的活性受到衰老的影响。以特异性探针底物表征了参与氟诺哌齐大鼠体内代谢的CYP1A2、CYP2C6、CYP2C11、CYP2D2、CYP3A1/2酶活性的变化。结果发现除了CYP3A的活性有显著降低外,其余酶活性没有显著差异。进一步的动力学研究结果显示,CYP3A底物咪达唑仑在老年大鼠肝微粒体的代谢速率约为年轻大鼠的1/6。本研究的结果说明年龄引起CYP3A酶活性下降导致的肝脏内在清除率的降低是氟诺哌齐血浆药动学变化的主要因素。3.氟诺哌齐的脑分布及摄取机制脑是一种异质性器官,包含多种结构区域,而药物在不同区域的分布与其药效息息相关。氟诺哌齐作为脑靶向药物,对其入脑机制和脑中药物的区域性分布的研究将为其药效作用的阐明提供动力学和空间依据。大鼠经灌胃给药0.5 mg/kg,5 mg/kg,25 mg/kg氟诺哌齐后,氟诺哌齐在大鼠体内的脑血分配比(Kp,brain)平均值分别为2.28、2.50和2.21,其在脑中药物总浓度高于血浆,易于分布入脑。本文建立了解吸电喷雾质谱成像（DESI-MSI）结合氘代内标校正的流程用于研究氟诺哌齐在大鼠脑中的分布成像,结果显示灌胃给药后,氟诺哌齐能迅速（1 h内）和广泛地分布于大鼠的各个脑区域中,特别是乙酰胆碱酯酶受体富集的纹状体、皮层、海马等结构区域。体外转运体研究结果显示,氟诺哌齐并非血脑屏障上与药物摄取转运相关的有机阳离子转运体（OCT1、OCT2、OCTN2）或有机阴离子转运体（OAT1、OAT2、OATP2B1）的底物,也不被P-糖蛋白（P-gp）,乳腺癌耐药蛋白（BCRP）介导外排。采用LC-MS/MS法测定血浆及脑组织中氟诺哌齐的游离率,发现血浆中游离率为脑组织游离率的2.09倍,即氟诺哌齐对脑组织亲和力高于血浆,这是具有高渗透性特征的氟诺哌齐从血浆被动扩散入脑的主要驱动力,导致了脑中暴露量高于血浆。4.老年因素对氟诺哌齐的脑分布影响以及对临床剂量的调整建议在研究老年因素对药物药动学影响时,常常关注的主要是血浆药动学变化,然而组织器官,尤其是药效作用的靶器官部位药物浓度的变化更能反应老年因素可能带来的药物作用影响,也与药物剂量的调整更加相关。从前面研究结果可知,氟诺哌齐主要经被动扩散入脑,且对脑组织和血浆蛋白亲和力的差异创造了驱动其入脑的势能差,老年因素是否会改变脑和血浆中的势能差以及脑内空间分布?在大鼠灌胃给药后,测定氟诺哌齐在脑组织和血浆中的游离率,发现老年和年轻大鼠在脑组织和血浆中的游离率比值没有显著性差异,表明氟诺哌齐在大鼠脑中药物浓度变化与血浆浓度变化一致。此外,DESI-MSI成像氟诺哌齐的脑分布结果显示,老年大鼠和年轻大鼠给药后的脑分布区域一致,未体现出明显差异。这些结果说明年龄因素不改变血脑分配比及空间分布,脑中药物浓度与血浆药物浓度具有良好的相关性。临床上在老年人群使用氟诺哌齐可考虑适当降低剂量,可在确保疗效的情况下减少不良反应。5.结论本文系统地研究了抗阿尔茨海默症候选新药氟诺哌齐的人体代谢、药动学、脑分布过程,以及老年因素带来的影响和机制,建立起了年龄相关的肝脏清除率的变化对氟诺哌齐体内药动学以及脑分布的影响关系。本文创新性和意义在于（1）阐明了氟诺哌齐在人体内的代谢命运和代谢表型。在人体内共鉴定出氟诺哌齐的14种代谢产物,代谢途径包括N-氧化、N-去邻氟苄基、O-去甲基等。氟诺哌齐主要经CYP3A酶代谢,贡献率为64%。CYP3A酶催化生成顺式-N-氧化物M11,而非化学合成的优势构型。M11可在全血中还原为原形药物。（2）研究了老年因素对氟诺哌齐及其两种主要代谢产物的人体药动学影响。发现老年受试者血浆中氟诺哌齐的暴露量增加49%,半衰期延长1.41倍,清除减慢44.7%。主要代谢物M1和M11的血浆暴露量占原形血浆暴露比例显著降低。（3）使用大鼠为模式动物阐明了老年因素对氟诺哌齐药动学影响的主要因素为衰老导致CYP3A酶活性显著降低,引起CYP3A介导的肝脏内在清除率减慢。（4）成功建立了DESI-MSI结合氘代内标校正的氟诺哌齐脑组织成像方法,揭示了氟诺哌齐脑中纹状体,皮层和海马等多个区域分布特征,总结了DESI-MSI成像方法优化的策略流程,将为其他研究者提供参考。（5）阐明了氟诺哌齐入脑机制是基于其对脑组织高亲和力的势能驱动下的被动扩散,并进一步发现老年因素引起的氟诺哌齐血浆暴露的升高将导致靶器官脑分布药物浓度的一致性升高。从而提示氟诺哌齐在临床使用时需要关注老年人群肝脏清除率的差异,建议适当地调整剂量以最大化药效和尽量减少不良反应。