传统的痛觉传导学说认为，疼痛是经外周，脊髓和脑中三级神经元的传递，最终被机体感知的，常表现为不愉快的感觉或情绪体验。在痛觉传递的过程中，若受到内，外因素的影响，就会出现异常性的疼痛，如痛觉过敏的发生。痛觉过敏作为一种异常的疼痛，主要表现为对温和的伤害性刺激敏感性增强，并可以发生于从外周到中枢的多级水平。众所周知，谷氨酸型NMDA受体在痛觉的突触传递中发挥着重要的作用。NMDA受体的大量开放，引起胞内Ca2+浓度升高，是中枢敏感化发生的重要基础。经典的NMDA受体主要是由NR1和NR2两个必须亚基构成的，这两个必须亚基可以受到多种因子的调节，从而引起NMDA受体的开放或关闭。尤其是NR1亚基上的胞内羧基端（Ser896）存在有磷酸化位点，有研究报道，该位点的磷酸化，可以调节NMDA受体活性，易化突触传递，从而参与了痛觉过敏的发生。近年来，越来越多的报道显示，不仅仅神经元参与了伤害性刺激的传递过程，胶质细胞也在传递过程中发挥着巨大的作用。胶质细胞一旦被激活（如外周的炎症刺激），可以释放一系列促炎症因子，如TNF-α，IL-1β，IL-6等，影响疼痛的传递，易化或者阻抑疼痛。有研究显示，外周的损伤或者炎症可以引起脊髓中胶质细胞活化，进而快速释放TNF-α，参与易化脊髓SH神经元之间的突触传递。另有研究显示，在低位脑干的RVM区域的神经元上，TNF-α受体TNFR1和NR1共表达，并且TNF-α释放增多可以上调p-NR1的表达。但在脊髓水平，外周炎症引起的TNF-α释放增多是否也可以上调p-NR1的表达，还不清楚。基于以上，我们进行如下实验设计，以证实是否脊髓背角TNF-α和其受体TNFR1通过对NR1亚基的磷酸化作用，参与了大鼠痛觉过敏的发生。整个实验主要包括三部分：1）通过对大鼠左后肢足底皮下注射CFA建立外周炎性痛模型，鞘内给予TNFR1抑制剂anti-rTNF-α，观察大鼠热痛反应和左右两侧脊髓背角NR1磷酸化水平的表达；2）通过鞘内直接给予TNFR1激动剂rTNF-α和/或TNFR1抑制剂anti-rTNF-α，观察TNF-α增多和激活或抑制TNFR1对大鼠热痛反应和左右两侧脊髓背角NR1磷酸化水平的影响；3）在大鼠炎性痛模型的基础上，鞘内直接给予胶质细胞抑制剂FC，对大鼠热痛反应和脊髓背角NR1磷酸化水平进行检测。实验动物全部采用雄性Sprague-Dawley大鼠（250-270g）进行，第一部分动物按照2×2双因素设计随机分为四组：< Saline+Vehicle >在生理盐水左侧足底皮下注射前24h，2h，以及注射后的23h，鞘内给予PBS（0.01M, pH 7.4, 5μl）于腰膨大处; < CFA+Vehicle>在CFA（0.08 ml, 40μg Mycobacterium tuberculosis）左侧足底皮下注射前24h，2h以及注射后的23h，鞘内给予PBS于腰膨大处；< Saline+anti-rTNF-α>在生理盐水（0.08 ml）左侧足底皮下注射前24h，2h以及注射后的23h，鞘内给予TNF-α抑制剂anti-rTNF-α（50fmol / 5μl或70 fmol / 5μl）于腰膨大处；< CFA+anti-rTNF-α>在CFA左侧足底皮下注射前24h，2h以及注射后的23h，鞘内给予anti-rTNF-α（剂量同前）于腰膨大处。所有四组均在外周CFA或生理盐水注射前24h，注射后的2h和24h进行PWL（缩足反射潜伏期）热痛行为检测，并对CFA或生理盐水脚掌注射后24h的脊髓背角（左侧/右侧）磷酸化NR1的表达分别进行Western Blot检测。热痛行为结果显示，相较对照组< Saline+Vehicle > , < CFA+ Vehicle >组在左侧足底皮下注射CFA后的2h即出现明显的PWL下降，且24h后仍未出现恢复（P< 0.05）；而< CFA+anti-rTNF-α>组结果显示，无论是鞘内给予anti-rTNF-α是较低剂量的（50 fmol / 5μl）还是较高剂量的（70fmol / 5μl），二者均可抑制PWL的下降，而且显然在一定范围内，随着抑制剂剂量的提高，反转PWL减少的作用就越强。Western Blot检测结果显示相较< Saline+Vehicle >对照组，< CFA+Vehicle >组CFA左侧足底皮下注射后，可以引起双侧NR1磷酸化（p-NR1）表达增加（P < 0.01），但左右两侧的p-NR1的含量无明显差异。而来自< CFA+anti-rTNF-α>的结果显示，当鞘内给予70fmol / 5μl的anti-rTNF-α后，相较< CFA+Vehicle >组该组双侧脊髓背角p-NR1表达水平均下调(P < 0.01)。这些结果表明：1）在CFA诱导的外周炎症痛觉过敏模型中，减少TNF-α与其受体TNFR1的结合，可以降低痛觉过敏的发生；2）脊髓背角NR-1亚基的磷酸化过程参与了CFA诱导的外周炎性痛觉过敏的发生，该过程可被TNF-α抑制剂anti-rTNF-α阻断。第二部分实验动物也按照2×2双因素设计随机分为四组：< Vehicle+Vehicle >在鞘内给予TNFR1激动剂Vehicle（含0.1%BSA的PBS，5μl）前1小时，鞘内给予TNFR1抑制剂Vehicle（0.01M, pH 7.4, 5μl PBS)；< Vehicle+rTNF-α>鞘内给予TNFR1激动剂rTNF-α（120 fmol / 5μl）前1小时，鞘内预先给予PBS；< anti- rTNF-α+Vehicle >鞘内给予Vehicle前1小时，鞘内给予anti-rTNF-α（70fmol，5μl）；< anti-rTNF-α+rTNF-α>鞘内给予rTNF-α前1小时，鞘内给予anti-rTNF-α。所有四组将：1）在鞘内给予rTNF-α或Vehicle后的0.5h和2h进行PWL热痛行为检测；2）鞘内注射rTNF-α或vehicle后2h用Western Blot技术检测双侧脊髓背角p-NR1的表达。热痛行为检测提示，< Vehicle+rTNF-α>组在鞘内给予TNFR1激动剂rTNF-α后0.5h，相较< Vehicle+Vehicle >组，PWL快速出现明显下降（P < 0.05），该反应可持续2h。但是在< anti-rTNF-α+ rTNF-α>组，当鞘内提前给予TNFR1抑制剂anti-rTNF-α后，PWL明显恢复并接近于对照组（P < 0.05）。Western Blot结果显示，相较< Vehicle+Vehicle >组，鞘内给予TNF-α后2h，两侧脊髓背角p-NR1的表达快速增加（P < 0.01）；但当预先鞘内给予TNFR1抑制剂anti-rTNF-α时，NR1磷酸化水平被明显反转（P < 0.01），而两侧脊髓背角p-NR1的表达没有明显差异。这说明rTNF-α可以通过激活TNFR上调脊髓背角NR-1磷酸化水平，并快速引起痛觉过敏的发生。实验结果表明：1）鞘内给予rTNF-α，可以快速地引起大鼠痛觉过敏，而预先鞘内给予anti-rTNF-α可以避免或减少痛觉过敏的发生；2）鞘内给予rTNF-α，可以快速地引起脊髓背角NR1磷酸化，而预先给予anti-rTNF-α可以有效地缓解NR1磷酸化水平的上调。第三部分实验动物依旧按照2×2双因素设计随机分为四组：< Saline+Vehicle >在生理盐水左侧足底皮下注射前3d，1h，鞘内给予PBS（0.01M，pH 7.4, 5μl）于腰膨大处; <CFA+Vehicle >在CFA（0.08 ml, 40μg Mycobacterium tuberculosis）左侧足底皮下注射前3d，1h，鞘内给予PBS于腰膨大处；< Saline+FC >在生理盐水（0.08 ml）左侧足底皮下注射前3d,1h，鞘内给予胶质细胞抑制剂FC（1nmol, 5μl）于腰膨大处；< CFA+FC >在CFA左侧足底皮下注射前3d,1h，鞘内给予FC (剂量同前）于腰膨大处。所有四组均在外周CFA或生理盐水注射前24h，注射后的2h和24h分别进行热痛行为PWL（缩足反射潜伏期）检测，并对CFA或生理盐水脚掌注射后24h的脊髓背角（左侧/右侧）磷酸化NR1的表达分别进行Western Blot检测。热痛行为结果显示，相较对照< Saline+Vehicle >组, < CFA+Vehicle >组在左侧足底皮下注射CFA后2h即出现明显的PWL下降，且24h后仍未出现恢复（P < 0.05）；而<CFA+FC >组结果显示，鞘内给予胶质细胞抑制剂FC可明显抑制PWL的下降（P < 0.05）。Western Blot检测结果显示相较< Saline+Vehicle >对照组，< CFA+Vehicle >组CFA左侧足底皮下注射后，可以引起双侧NR1磷酸化（p-NR1）表达增加（P < 0.05），但左右两侧的p-NR1的含量无明显差异；而来自< CFA+FC>的结果显示，当鞘内给予FC后，相较< CFA+Vehicle >组该组双侧脊髓背角p-NR1表达水平均下调（P < 0.05）。这些结果表明：1）在CFA诱导的外周炎症痛觉过敏模型中，激活的胶质细胞参与了痛觉过敏的发生；2）胶质细胞可能通过释放TNF-α，进而引起脊髓背角p-NR1的表达上调，参与了痛觉过敏的发生。结论：1）外周炎症时脊髓腰膨大处的TNF-α及其受体TNFR1通过上调脊髓背角p-NR1的表达参与了CFA诱导的大鼠痛觉过敏；2）TNF-α及其受体TNFR1可以通过上调脊髓背角NR1的磷酸化，使传递痛信号的突触发生可塑性改变，最终导致痛觉过敏和异常疼痛的发生；3）伤害性信息传入时，激活的胶质细胞释放的TNF-α是脊髓上调痛信号传递的重要原因。