论文部分内容阅读
研究背景:结核病是严重危害人类健康的疾病之一。根据WHO提供的最新数据,2018年全球人口中约有900-1110万新发结核病患者,结核病目前仍然是全球十大死亡原因之一,是单一传染性病原体的主要死因(Global tuberculosis report 2019,WHO)分枝杆菌是目前全球造成人类死亡三大传染病之一,侵袭自体的固有免疫系统和适应性免疫系统。机体内的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)是结核病病原体,巨噬细胞作为结核分枝杆菌侵入固有免疫系统的主要靶细胞,巨噬细胞和结核杆菌的相互作用与氧化应激、自噬息息相关。转录因子NF-E2相关因子2(nuclear factor-E2-related factor,NRF2)及其介导的信号通路在抵抗微生物感染及炎症损伤过程中的作用,正得到越来越多的关注。作为抗氧化系统的中枢调控因子,NRF2与氧化应激相关的老龄化相关。我们在前期研究中发现,结核病患者NRF2表达水平显著高于健康对照组。因而,本研究旨在探讨转录因子NRF2在老龄大鼠巨噬细胞结核分枝杆菌易感性中的作用及其机制。方法:(1)通过RNA-seq技术检测年轻组和老龄组结核病患者和隐性结核感染者外周血PBMC(peripheral blood mononuclear cell)NRF2基因线性RNA表达水平,分析其与年龄的相关性。(2)通过实时荧光定量PCR(real-time quantitive PCR,q-PCR)技术,检测SD大鼠年轻组和老龄组外周血PBMC中NRF2表达水平差异。(3)通过q-PCR技术,检测M.tb感染SD大鼠年轻组和老龄组大鼠肺泡巨噬细胞后,细胞内的NRF2和抗氧化物SOD-1、NOX-1、NOX-2、NOX-4以及IL-12P35、IL-12P40基因转录表达水平。(4)利用蛋白质印迹技术(Western Blot,WB)来检测M.tb感染SD大鼠年轻组和老龄组肺泡巨噬细胞NRF2、LC3-Ⅱ蛋白表达水平。(5)利用流式细胞术检测SD大鼠年轻组和老龄组肺泡巨噬细胞对M.tb吞噬率与凋亡率的差异。(6)利用流式细胞术检测M.tb感染SD大鼠年轻组和老龄组肺泡巨噬细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)变化差异。(7)使用WB技术检测NRF2抑制剂Brusatol预处理后,M.tb感染SD大鼠年轻组和老龄组肺泡巨噬细胞NRF2、P62蛋白水平的影响。结果:(1)RNA-seq测序结果显示:健康对照组以及各组结核杆菌患者PBMC中NRF2线性RNA基因表达均与年龄之间呈现显著相关性(P<0.05),但未见年龄与结核病发病之间存在显著相关性。(2)SD大鼠年轻组和老龄组外周血PBMC中NRF2表达水平有统计学差异(P<0.05,n=3),年轻组SD大鼠NRF2表达量在转录水平和蛋白水平都要低于老龄SD大鼠组。(3)M.tb感染SD大鼠年轻组和老龄组肺泡巨噬细胞后,NRF2 m RNA水平与对照组相比显著降低(P<0.05,n=3),且年轻组SD大鼠组要显著高于老龄组(P<0.05,n=3);M.tb感染后年轻组大鼠NRF2蛋白水平高于老龄组(P<0.05,n=3)。(4)M.tb感染SD大鼠年轻组和老龄组肺泡巨噬细胞6 h后,老龄组和年轻组SOD-1m RNA、NOX-1 m RNA、NOX-2 m RNA、IL-12P35 m RNA、IL-12P40 m RNA表达水平相对于对照组水平显著升高,NOX-4m RNA表达水平降低(P<0.05,n=3);老龄组SOD-1 m RNA、NOX-4 m RNA、IL-12P35 m RNA表达水平低于年轻组;老龄组NOX-2 m RNA、IL-12P40 m RNA、NOX-1 m RNA表达水平高于年轻组(P<0.05,n=3)。(5)M.tb感染SD大鼠年轻组和老龄组大鼠肺泡巨噬细胞后,年轻组SD大鼠自噬蛋白LC3-Ⅱ在蛋白水平高于老龄组SD大鼠组(P<0.05,n=3),且年轻组未感染组高于老龄组未感染组(P<0.05,n=3)。(6)老龄组SD大鼠肺泡巨噬细胞对M.tb-FITC的吞噬率在2 h、4 h、6 h均高于年轻组SD大鼠组,且随时间变化延长吞噬率也不断增高;Brusatol预处理后,会降低肺泡巨噬细胞的吞噬率(P<0.05,n=3)。(7)M.tb感染老龄组SD大鼠肺泡巨噬细胞后2 h、4 h、6 h凋亡率显著高于年轻组SD大鼠,且随时间变化凋亡率也不断增高(P<0.05,n=3)。(8)M.tb感染30 min后,老龄组SD大鼠肺泡巨噬细胞ROS水平显著高于年轻组SD大鼠(P<0.05,n=3)。(9)与对照组比较,Brusatol预处理后,M.tb感染肺泡巨噬细胞P62蛋白表达被完全抑制;M.tb感染后,年轻组SD大鼠P62蛋白水平显著高于老龄组SD大鼠(P<0.05,n=3);年轻组SD大鼠NRF2蛋白水平显著低于老龄组SD大鼠(P<0.05,n=3)。结论:(1)老龄大鼠肺泡巨噬细胞NRF2水平的降低与其对M.tb的易感性有关(2)NRF2通过调控胞内氧化应激水平和自噬受体P62增强巨噬细胞对M.tb的易感性。