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睡莲科植物莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)的种子胚芽----莲子心是广泛应用的食品和传统中药材,有清心理气、去热固精血之效。甲基莲心碱和类似物莲心碱、异莲心碱是莲子心生物碱的主要成分,它们的母核相似但甲氧基数量和位置不同,同属于双苄基异喹啉单醚键型生物碱。诸多研究证实此三种生物碱均具有抗心律失常、降压等心血管效应,其中甲基莲心碱还具有抗肿瘤、抗HIV的功效。文献调研表明甲基莲心碱能下调P-gp的表达逆转多药耐药性,莲心碱口服吸收差、脑中分布量少,提示莲子心生物碱与ABC转运体可能存在相互作用。本文利用稳定高表达人源P-gp及MRP2的MDCK转基因细胞系进行体外转运研究预测甲基莲心碱及类似物的体内处置过程。此外,甲基莲心碱增强抗癌药物诱导细胞凋亡及自身直接的抗肿瘤机制尚不明确。因此,本文从代谢激活的角度重点研究甲基莲心碱人肝微粒体的代谢情况以及应用稳定高表达人源CYP3A4的MDCK转基因细胞系及人肝癌细胞系HepG2阐明甲基莲心碱的代谢增毒机制。1.甲基莲心碱和类似物与ABC转运体相互作用的研究为阐明甲基莲心碱和类似物与ABC转运家族的相互作用解释其吸收和分布特征,本章应用实验室构建的稳定高表达外排转运体的MDCK细胞模型进行细胞积聚和双向转运实验。MTT实验测定三种生物碱对细胞的毒性,为后续实验选择合适的药物浓度提供依据。细胞积聚实验表明甲基莲心碱和类似物在MDCK-MDRl细胞的积聚量明显少于MDCK细胞,并且P-gp的外排作用能被抑制剂逆转提示三种生物碱均可能是P-gp的底物。甲基莲心碱、莲心碱及异莲心碱在细胞单层膜的双向转运实验中净外排率均大于2,加入P-gp的经典抑制剂GF120918和CsA均能使净外排率降至1左右,说明三者均为P-gp的底物。但甲基莲心碱与异莲心碱在高浓度时净外排率显著下降,提示P-gp对两者的转运存在饱和现象。实验测得3个生物碱的Papp (A-B)均小于3×10-6cm/s,其中莲心碱在10-40μM浓度范围内Papp(A-B)<1×10-6Cm/s,表明莲子心生物碱的透膜能力较弱预测体内口服吸收较差。此外,莲心碱在MDCK-MRP2与MDCK细胞的积聚量相似,双向转运实验没有表现出显著的方向性,所以莲心碱不是MRP2的底物。2.甲基莲心碱的体外代谢研究初步推测甲基莲心碱人肝微粒体孵育的主要代谢产物结构,对甲基莲心碱的相关代谢酶进行确证并测定去甲基氧化反应的酶动力学参数。本章利用LC-MS/MS碎片信息与前期甲基莲心碱狗肝微粒体代谢的代谢物结构信息,与莲心碱、异莲心碱标准品的保留时间对照初步推测代谢物主要分为两类,二去甲基产物(M1,m/z597.4)和去甲基产物(M2-1, m/z611.4, M2-2和M2-3,m/z611.3)初步推测分别为2-N-2’-N-去二甲基甲基莲心碱,莲心碱,2’-N-去甲基甲基莲心碱,2-N-去甲基甲基莲心碱。运用化学抑制剂法和重组表达人细胞色素P450酶的方法对甲基莲心碱代谢酶亚型进行确证,结果表明CYP3A4参与了所有去甲基代谢物的生成,CYP2C8和CYP2D6则主要分别参与了去甲基代谢物M2-3和M2-2的生成,计算相关酶动力学参数。在人肝微粒体孵育体系中,甲基莲心碱代谢为4个亚甲基醌反应性代谢产物能被亲核试剂GSH捕获,分别为M3([M+H]+, m/z902.4), M4-1([M+H]+,m/z916.4), M4-2([M+H]+, m/z916.4)及M5([M+H]+, m/z930.4).同样利用化学抑制剂法和单一重组P450酶方法确证CYP3A4是参与甲基莲心碱氧化代谢生成亲电子中间体的主要代谢酶。GSH浓度依赖性实验表明甲基莲心碱反应性代谢物与GSH结合存在非酶催化,GSTA1, GSTT1及GSTP1亚型催化形成M3, M4-1, M4-2和M5的作用微弱,预测GSTT1等位无效突变体对甲基莲心碱的代谢解毒无显著影响。3. CYP3A4介导的甲基莲心碱细胞毒性研究从代谢增毒角度研究甲基莲心碱潜在的肝毒性,为甲基莲心碱的抗肿瘤增敏和直接抗肿瘤活性提供理论依据和实验数据。对比MTT实验甲基莲心碱与类似物莲心碱、异莲心碱对人肝癌细胞系HepG2的细胞毒性,说明甲基莲心碱的细胞毒性最大并且随着给药时间延长毒性增强。为说明甲基莲心碱反应性代谢物对细胞生存的影响,在稳定高表达人源CYP3A4的MDCK细胞模型加入GSH的合成阻断剂BSO和氧化清除剂NAC进行MTT研究。IC50(mock+Nef)28.65±1.08μM> IC50(MDCK-CYP3A4+Nef+NAC)25.77±1.08μM> IC50(MDCK-CYP3A4+Nef)19.34±1.04μM> IC50(MDCK-CYP3A4+Nef+BSO)12.49±1.06μM,结果显示BSO增强甲基莲心碱对MDCK-CYP3A4细胞毒性,而NAC保护细胞减弱毒性作用,与MDCK-CYP3A4细胞相比,mock细胞对甲基莲心碱更耐受。不同给药组在HepG2细胞模型上亦表现出相同的趋势甲基莲心碱对利福平诱导HepG2细胞毒性最明显,与BSO联用组其次,即IC50(HepG2+Nef)36.55±1.06μM> IC50(HepG2+Nef+NAC)35.64±1.13μM> IC50(HepG2+Nef+BSO)27.02±1.03μM> IC50(HepG2+Nef+Rif)15.05±1.22μM>。此外,在HPLC法测定细胞内GSH水平实验中可以发现GSH含量均表现为给药后时间依赖性的不同程度的下降,MDCK-CYP3A4细胞的GSH含量下降幅度大,速度明显快于mock细胞,并且甲基莲心碱处理MDCK-CYP3A4细胞,其细胞内的GSH含量均受到联用剂BSO和NAC的影响。