[研究背景及目的]自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)是一种病因和发病机制尚未完全阐明的,以血清转氨酶升高、循环中出现多种自身抗体、高球蛋白血症、肝组织出现界面性肝炎、淋巴细胞浸润以及纤维化改变,好发于女性为特点的慢性肝脏炎症性病变。其发病过程可能涉及到遗传易感性、环境诱发因素、自身抗原、免疫紊乱等多种因素之间复杂的相互作用,最终免疫耐受被打破,引起针对肝脏自身抗原的免疫反应,从而破坏肝细胞导致肝脏炎症坏死,并可进展为肝纤维化、肝硬化。目前国内外对自身免疫肝炎发病机制的研究主要集中在遗传易感因素(HLA上存在AIH主要易感等位基因；TCR在遗传学上的影响等)、肝细胞损伤机制(CD4+T及CD8+T均参与)、免疫调节网络(自身抗原的提呈,免疫细胞激活、细胞因子网络(TH1/TH2细胞失衡)),以及交叉反应(外来抗原和自身抗原间的分子模拟是自身免疫性疾病的诱因之一,如病毒感染,药物刺激,破坏自身耐受,从而最终导致疾病的发生)等方面,其中对于免疫调节和肝细胞损伤机制的相关研究最引为关注。免疫介导的炎症损伤在疾病发生中处于重要地位,TH1细胞介导的细胞免疫反应和TH2细胞介导的体液免疫均参与了自身免疫性肝炎的发生发展。近年来研究发现,TH17细胞也是引起自身免疫性疾病组织损伤的重要细胞。IL-17A是TH17细胞分泌的特征性细胞因子和重要炎症介质,与受体结合可激活炎症瀑布效应引起组织损害；炎症又是启动和促进肝纤维化进展的重要因素。自身免疫性肝炎的病理特征为大量炎性细胞浸润于汇管区,并向周围的肝实质侵犯。免疫组织化学研究证实浸润的炎性细胞主要包括CD4+T细胞,CD8+T细胞,此外还包括单核细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞等,因此对各种免疫细胞及其分泌的细胞因子形成的免疫网络在免疫肝损伤中的研究有利于了解自身免疫肝炎的发病机制。CD4+CD25+FOXP3+调节性T淋巴细胞(Treg)是一群专职抑制针对自身或外来抗原免疫反应的细胞,在维持免疫平衡中发挥重要作用。既往研究普遍认为自身免疫性肝病患者体内的Treg数量及功能可能存在缺陷,在疾病活跃期更为明显。胆汁性肝硬化患者外周血Treg比例降低,肝内CD8+T淋巴细胞/FOXP3+Treg比值高于慢性HCV感染及早期自身免疫性肝炎患者,同时Treg功能也存在缺陷。这些研究结果表明Treg功能受损可能有助于自身免疫性肝病的发生,并起到加重的作用。而最近也有学者认为自身免疫肝炎患者Treg的数量和功能并未下降。Treg的特异染色标志和功能学实验方法体系的差异,以及检测部位和评判标准的不同可能导致了研究结果的不同和争议的存在。因此,针对不同部位尤其是外周血和肝脏,重新评估自身免疫性肝炎患者Treg的数量和功能有助于深刻理解和深入挖掘AIH发病机制。传统观念认为Treg细胞发挥作用的主要抑制性细胞因子有IL-10和TGF-β,而近年来有研究证实纤维介素蛋白2(FGL2)可作为Treg新型效应分子发挥免疫抑制作用,在自身免疫性肾小球肾炎以及MHV-3诱导的鼠暴发性肝炎的研究中表明,FGL2是CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞发挥抑制效应的机制之一,最近还发现FGL2与慢性丙型肝炎的疾病严重程度密切相关,然而关于FGL2在自身免疫性肝炎中的作用则鲜有报道。因此,我们收集自身免疫性肝炎患者临床资料及标本,并建立实验性自身免疫性肝炎小鼠模型,对Treg细胞的数量和功能进行评估,并对Treg表达的FGL2的作用和作用机制进行了相关研究,同时对血浆FGL2的表达与自身免疫性肝炎炎症病理改变的关系做了初步的研究和探讨,以期为自身免疫性疾病的诊断和治疗提供新的理论依据和策略。具体研究目标如下：1、选取自身免疫性肝炎患者为研究对象(1)收集AIH患者及健康对照外周血和肝穿标本,研究Treg细胞数量变化和FGL2的表达定位情况；(2)检测血浆TH1/TH2/TH17细胞因子及FGL2表达水平,分析FGL2与TH1/TH2/TH17细胞因子谱及临床参数关系的相关性,并对不同炎症分级和纤维化分期的FGL2表达水平进行评估。2、以C57BL/6小鼠建立实验性自身免疫性肝炎模型为研究对象(1)观察EAH模型外周血、肝和脾Treg细胞数量变化和FGL2的表达定位情况；(2)检测血浆TH1/TH2/TH17细胞因子表达水平和FGL2表达水平；分析FGL2与TH1/TH2/TH17细胞因子谱及肝功能的相关性；(3)探讨Treg与FGL2体外影响效应细胞的功能学机制；[研究方法]1、利用流式细胞术分析AIH患者和健康对照外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞的表达频数；采用免疫组织化学技术检测两者肝组织中FOXP3和FGL2的表达情况；通过免疫荧光组织染色在肝脏中行FOXP3与FGL2双染以判别两者是否可表达于同一细胞；2、建立实验性自身免疫性肝炎小鼠模型。流式细胞术检测正常组和模型组小鼠外周血、肝脏及脾脏CD4+CD25+FOXP3+Treg表达频率；免疫组织化学技术和Realtime-PCR检测两组肝组织中FOXP3和FGL2的表达情况；通过激光免疫共聚焦和免疫荧光组织染色分别在CD4+CD25+Treg细胞和肝脏中行FOXP3与FGL2双染以判别两者是否可表达于同一细胞；3、体外实验：免疫磁珠分选出免疫注射后2-4w的模型组小鼠脾脏CD4+CD25+Treg, CD4+CD25T细胞,CD8+T细胞。Elisa法检测CD4+CD25+Treg细胞培养上清FGL2表达水平,Realtime-PCR检测三种细胞FGL2mRNA表达水平和CD4+CD25+Treg中的FOXP3、IL-10、TGF-β1mRNA表达水平。流式细胞仪技术分析EAH小鼠CD8+T细胞胞内IFN-y和IL-17A表达水平；将CD4+CD25+Treg细胞与CD8+T淋巴细胞进行混合培养,流式细胞仪技术检测Treg细胞分泌的FGL2以及抗体阻断FGL2对CD8+T淋巴细胞的增殖抑制作用和其分泌的细胞因子(IFN-y, IL-17A)的表达影响。另外将外源性FGL2按不同梯度浓度加入到CD8+T细胞培养体系中,观察对CD8+T细胞胞内IFN-y, IL-17A表达影响。4、采用流式细胞微球芯片捕获技术(cytometric bead array, CBA)动态检测模型组2次免疫注射0w、1w、2w、3w、4w、5w、6w后模型小鼠血浆TH1/TH2/TH17细胞因子(IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17)表达水平；ELISA法检测上述各时间点血浆FGL2表达水平,统计分析血浆FGL2与TH1/TH2/TH17细胞因子和肝功能的相关性。5、CBA法检测AIH患者血浆TH1/TH2/TH17细胞因子表达水平；运用Elisa法检测血浆FGL2表达水平,统计分析FGL2与TH1/TH2/TH17细胞因子相关性；并对不同肝脏炎症分级和纤维化分期的AIH患者血浆FGL2表达水平进行对比分析。[结果]1、AIH患者外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞比例较正常组下降,而肝内FOXP3表达水平高于正常对照。AIH患者肝内FGL2表达较健康对照亦增强。肝组织免疫荧光组织染色检测证实FGL2与FOXP3可表达于同一细胞。2、成功建立自身免疫性肝炎小鼠模型,其外周血和脾脏CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞比例较正常组下降,而肝脏内则有所增加。模型组肝组织FOXP3在mRNA和蛋白水平均增加。模型组肝内FGL2表达水平较正常对照亦增强,与AIH患者的相关变化趋势一致。激光免疫共聚焦和肝组织免疫荧光染色定位检测证实FGL2与FOXP3可表达于同一细胞。3、体外实验：模型组CD4+CD25+Treg的FGL2mRNA表达水平显著高于CD4+CD25’T细胞及CD8+T细胞,其FOXP3, TGF-β1, IL-10mRNA表达水平低于正常组,而FGL2mRNA水平则增强,且CD4+CD25+Treg细胞培养上清FGL2表达水平亦高于正常组。模型组CD8+T细胞胞内IFN-y和IL-17A表达水平明显高于正常组。细胞混合培养实验表明模型组CD4+CD25+Treg抑制了CD8+T细胞增殖和IFN-y,IL-17A的分泌,而抗体中和FGL2后其抑制增殖效应减弱。外源性FGL2亦可抑制CD8+T细胞胞内IFN-y和IL-17A的表达水平。4、模型组小鼠血浆IL-2, IFN-y, TNF-a, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A的水平在造模后均逐渐升高并在第2w时达到最高峰值,随后下降,其中TNF-a, IL-6, IL-10在下降后迅速从第3w开始再次逐渐升高并于第5w时达到另一高峰,随后下降。血浆FGL2表达水平在造模后亦逐渐升高并于第5w左右达到高峰,且与ALT, AST水平无明显相关性。5、AIH患者血浆IL-10及IL-17A表达水平较健康对照明显升高,IL-4及IFN-y水平下降,IL-2, TNF-a以及IL-6表达水平无显著性差异。AIH患者血浆FGL2表达水平较健康对照明显升高,且与TBil和IL-17A水平成正相关,而与ALT,AST,DBil, ALP, r-GT, LDH, ALB, INR, PTA以及纤维蛋白原无明显相关性。随着肝脏炎症程度(G1-G3)和纤维化(S0-S4)的加重,血浆FGL2水平呈逐渐升高趋势。[结论]1、本研究从外周和肝内两方面评估了自身免疫性肝炎患者及动物模型中CD4+CD25+FOXP3+Treg的数量,发现其比例在外周血下降而在肝脏局部可代偿性或募集增加。EAH中Treg本身表达TGF-β1和IL-10mRNA水平下降。Treg在外周数量的减少和抑制性细胞因子(TGF-β1和IL-10)表达的降低可能是Treg免疫负性调控不足而至疾病发生发展的原因之一。2、FGL2在EAH中表达水平较正常对照增高,并在Treg上高表达,血浆FGL2水平变化与外周血Treg比例变化基本保持一致,抗体中和FGL2后Treg抑制效应细胞增殖和细胞因子分泌效应减弱,表明在转录因子FOXP3及细胞因子TGF-β1和IL-10表达水平下降的情况下,FGL2可做为Treg分泌的另一细胞因子发挥重要免疫抑制作用,即抑制CD8+T细胞增殖和细胞因子IFN-y, IL-17A的产生。3、FGL2与临床参数相关性分析显示血浆FGL2表达水平与TBiL成正相关,与TH1/TH2/TH17细胞因子相关性分析显示血浆FGL2与IL-17A成正相关。说明FGL2参与了自身免疫肝炎的发生发展,与肝脏损伤密切相关。在EAH中动态观察发现血浆IL-17A等细胞因子的表达高峰先于FGL2出现,说明FGL2可能是代偿性增加来抑制IL-17A等的致病效应。这一研究发现有助于深入理解自身免疫肝炎的发病机制并可能为临床诊断和治疗提供新的参考和策略。