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钾元素是植物生长必须的三大基本营养元素之一,土壤中钾元素的含量对植物的生长和发育、农业生产的可持续发展有重要影响。我国钾元素资源主要以含钾量颇为丰富的钾长石为典型代表,通过将钾长石不可溶性钾转化为可溶性钾,以供植物吸收利用,缓解我国土壤可溶性钾不足的现状。近年来,低成本、低能耗、绿色环保的微生物解钾方法已广泛应用于生产微生物钾肥,但高效解钾菌资源匮乏,从而限制了我国微生物钾肥的工业化生产。本研究采用基因组改组技术,通过建立物理、化学诱变手段,构建解钾突变菌库,采用“递归式融合”的方式,以获得高效钾长石分解菌株,能将不溶性钾高效转化为可溶性钾,有效利用我国丰富钾长石资源,在促进我国微生物工业迅速发展方面提供技术指导与理论支撑。以本实验室保存的蜡样芽孢杆菌L18(Bacillus cereus)KF494191为出发菌株,通过亚硝基胍(NTG)和紫外(UV)诱变构建正向突变菌库,研究表明:0.6g/L反应20 min、照射0.1 ml菌悬液(107-108 cfu/mL)涂布的平板菌20 s为最佳诱变条件,通过筛选获得两株解钾能力有不同程度提高且传代性能稳定的正向突变菌株,将其命名为L18-NTG-151和L18-UV-68。以L18-NTG-151和L18-UV-68作为出发菌株,进行原生质体融合,其原生质体最佳制备体系为:溶菌酶浓度1.5 g/L,温度37oC,转速85 r/min,酶解1 h,其形成率与再生率分别为97.56%和36.46%。采用紫外(UV)和加热两种方式分别进行原生质体灭活条件的筛选,其中,UV灭活最佳条件为:106的菌液,照射5 min;热灭活最佳条件为:温度70oC,水浴60 min;原生质体融合反应条件为:35%PEG6000,温度20oC,水浴15 min后,其融合率为4.64%。经过3轮递归式融合,并继代培养5代,最终获得一株高效解钾菌株L18-F3-46,其发酵液钾含量为277.93 mg/L,相比原始出发菌株L18提高2.58倍,与诱变菌株L18-NTG-151和L18-UV-68相比提高1.23倍,且具有良好的遗传稳定性。通过单因素试验与正交试验优化改组菌株L18-F3-46培养条件,研究表明:当9 g/L的蔗糖作为唯一碳源、pH=7、钾长石含量3 g/L、温度30oC、转速200r/min为培育条件时,培养96 h后L18-F3-46显示出最好的解钾能力,为290.57mg/L。可见,通过运用基因组改组技术,可大幅度提高蜡样芽孢杆菌L18的解钾能力,获得了高效解钾菌株,并通过解钾特性研究优化了该菌株培育条件,充分发挥其解钾能力,具有广阔的工业应用前景。