幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp),是胃炎、消化道溃疡的主要致病因素之一,与胃癌的发生密切相关,由于人群感染率高、危害大,世界卫生组织已将其列为第一类致癌因子。传统抗菌素治疗存在着治愈率低、复发率高和菌株耐药性等问题,开发新型的抗菌药物成为亟待解决的问题。 寻找特异、准确的靶位是筛选新型抗菌药物的关键。与哺乳动物相比,细菌的蛋白合成具有其特点。细菌蛋白质合成后,其多肽链N-端为甲酰化的蛋氨酸,需要首先通过肽脱甲酰基酶(peptide deformylase, PDF)去除甲基后才能成为成熟蛋白,否则不能完成上述过程,细菌无法生长。因此,PDF成为药物筛选的新型和潜在的靶位。 本实验选择了幽门螺杆菌国际标准株1株、澳大利亚株1株和我国不同地区(华北、华东、西南、华南)的12个分离株,对其def基因进行了克隆及序列比较,并尝试了在不同载体中进行表达。根据GenBank已公布的幽门螺杆菌国际标准株26695、J99的肽脱甲酰基酶基因(deformylase, def)的核苷酸序列,在培养鉴定的基础上提取细菌DNA,设计特异引物,以PCR方法扩增了def,并克隆到pGEM-T easy载体中。序列分析表明,所克隆的不同菌株的def基因均为525bp,核苷酸序列的一致性达到了97.50%,氨基酸序列的一致性高达98.13%,与功能相关的基序点未发生变异。这一结果表明,与其它细菌相同,Hp具有肽脱甲酰基酶基因(def)的高度保守性。本工作为表达PDF奠定了基础,同时,为以PDF为靶位筛选抑制剂提供了理论基础。 选取和其它株同源性较高的DM株,将def基因克隆入pET-32a(+)表达载体,在宿主细胞BL21(DE3)中进行表达。结果显示,def基因可以融合蛋白的形式高效表达,但产物大部分以包涵体形式存在,可溶部分含量较低。通过金属螯和亲