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目的:胰腺癌恶性程度高、起病隐匿、进展快、预后差,至今胰腺癌发生、发展的具体机制尚不清楚。我们前期对临床样本（胰腺导管腺癌组织）初步筛查发现:癌组织存在降钙素基因相关肽（Calcitonin gene-Related Polypeptide,CGRP）基因启动子区CpG岛甲基化。据此,我们推测胰腺癌（导管腺癌）的发生发展可能与CGRP高甲基化导致CGRP低表达有关。为进一步验证假设,本研究继续扩大样本量并应用焦磷酸测序法、亚硫酸氢盐修饰后测序法和甲基化特异性PCR法进一步检测CGRP两个亚型（CALCA和CALCB,分别表达αCGRP和βCGRP）甲基化水平。另外,由于CALCA表达量占90%以上,因此我们构建CALCA基因敲除SD大鼠（CGRP-KO）模型,验证由于CGRP基因启动子区CpG岛甲基化造成CGRP低表达与胰腺癌（导管腺癌）之间的关系,并寻找其可能的致病机制。方法:（1）甲基化特异性PCR（MSP）:提取63对胰腺癌（导管腺癌）组织DNA经转化及甲基化特异性PCR（Methylation specific PCR,MSP）扩增之后,电泳测定CGRP基因启动子区CpG岛甲基化状态;（2）焦磷酸测序:7例胰腺癌（导管腺癌）患者的癌与癌旁组织、4例胰腺癌（导管腺癌）患者和3例健康对照者外周血DNA样本,经重亚硫酸氢盐处理及PCR扩增之后测序,测定CGRP基因启动子区CpG岛甲基化水平（以癌旁组织及健康对照者的外周血为参照）;（3）亚硫酸氢盐修饰后测序法（BSP）:胰腺癌（导管腺癌）患者的癌组织和癌旁组织DNA经重亚硫酸氢盐转化后测序分析,测定CGRP基因启动子区CpG岛甲基化水平（以癌旁组织为参照）;（4）H＆E染色、免疫组织化学（immunohistochemical,IHC）和免疫荧光（Immunofluorescence,IF）分析CGRP在胰腺癌（导管腺癌）组织与癌旁组织中表达差异;（5）构建CGRP基因敲除（CGRP-KO）大鼠,繁殖扩群,子代基因型鉴定;（6）H＆E染色观察CGRP敲除大鼠病理学变化;（7）选取同窝8周龄5对CGRP敲除大鼠和野生型大鼠,取其胰腺通过Western blot、IHC和IF对可能的通路蛋白AKT、p-AKT、CREB、p-CREB进行检测;（8）胰腺癌（导管腺癌）患者组织做Western blot、IHC和IF对通路蛋白AKT、p-AKT、CREB、p-CREB进行验证。结果:（1）焦磷酸测序结果表明胰腺癌（导管腺癌）组织中CALCA基因启动子区CpG岛甲基化百分比平均值为13.14%,癌旁组织中的甲基化百分比平均值为3.00%,癌组织甲基化百分比显著高于癌旁（P=0.0035）;胰腺癌（导管腺癌）组织中CALCB基因启动子区CpG岛甲基化百分比平均值为13.57%,癌旁组织中甲基化百分比平均值为4.29%,癌组织甲基化百分比显著高于癌旁（P=0.005）;而在全血水平,胰腺癌（导管腺癌）患者和正常人的CALCA基因（P=0.1174）和CALCB基因（P=0.4481）启动子区CpG岛甲基化的百分比差异无统计学意义;（2）BSP表明胰腺癌（导管腺癌）中CGRP甲基化水平较癌旁高,CALCA基因启动子区CpG岛甲基化百分比为4.2%,而癌旁组织甲基化百分比为0.7%;癌组织中CALCB基因启动子区CpG岛甲基化百分比为57.5%,而癌旁组织甲基化百分比为11.4%;（3）MSP结果显示胰腺癌（导管腺癌）组织CGRP基因启动子区CpG岛甲基化频率高于癌旁组织（P<0.05）,54例胰腺癌（导管腺癌）组织中出现CALCA基因启动子区CpG岛甲基化（88.52%）,而癌旁组织仅36例发生甲基化（57.14%）;56例胰腺癌（导管腺癌）组织出现CALCB基因启动子区CpG岛发生甲基化（91.80%）,而癌旁组织仅29例发生甲基化（46.03%）;（4）免疫组化与免疫荧光表明,CGRP在胰腺癌组织的表达低于癌旁组织;（5）CGRP基因敲除SD大鼠模型（CGRP-KO）成功构建,子代（F1～F6）大鼠生长发育状况良好,子代大鼠可鉴定出纯合子、杂合子和野生型三种,且子代比例符合孟德尔遗传定律;（6）组织病理显示CGRP敲除鼠出现胰腺血管增生或炎症细胞反应;（7）Western blot显示癌组织AKT信号通路上p-AKT/AKT和p-CREB/CREB表达低于癌旁（P<0.05）,CGRP敲除大鼠胰腺组织中p-AKT/AKT和p-CREB/CREB低于野生型（P<0.05）;（8）免疫组化和免疫荧光提示:在临床样本中,癌组织AKT、p-AKT、CREB和p-CREB表达低于癌旁（P<0.05）;在动物模型中,CGRP敲除大鼠胰腺组织中AKT、p-AKT、CREB和p-CREB表达低于野生型（P<0.05）。结论:（1）胰腺癌（导管腺癌）存在CGRP基因启动子区CpG岛高甲基化;（2）CGRP-KO大鼠胰腺组织出现血管增生或炎症细胞反应;（3）CGRP基因高甲基化（CGRP低表达）可能通过AKT-CREB信号通路促进胰腺癌（导管腺癌）的发生发展。