论文部分内容阅读
背景:肝纤维化是性别相关性疾病,并且多发于男性。课题组前期研究表明,植物雌激素毛蕊异黄酮在体内可发挥良好的抗肝纤维化作用,该作用与JAK2-STAT3信号通路及雌激素受体β（ERβ）有关;在体外可以抑制肝纤维化形成关键细胞肝星状细胞（HSC）功能,且该作用也与ERβ密切相关。目的:进一步探讨ERβ在毛蕊异黄酮发挥抗肝纤维化中的作用及其与JAK2-STAT3信号通路在ERβ过表达人肝星状细胞（LX-2）中的关系。方法:ERβ过表达慢病毒转染LX-2细胞,荧光显微镜观察转染细胞中绿色荧光确定转染率,采用实时荧光定量PCR和western blotting检测ERβm RNA和蛋白表达水平,以鉴定慢病毒转染是否成功;使用CCK-8法筛选毛蕊异黄酮的安全作用浓度（25,50,100,200,300,600μM）;分别采用CCK-8和Transwell小室法检测ERβ过表达和毛蕊异黄酮对TGF-β1诱导的LX-2细胞增殖和迁移能力的影响;免疫荧光法和western blotting检测α-SMA蛋白的表达;Western blotting检测ERβ过表达和毛蕊异黄酮对TGF-β1诱导的LX-2细胞中COL-I,MMP1,TIMP1,JAK2,p-JAK2,STAT3,p-STAT3的蛋白表达;Western blotting检测加入雌激素受体完全阻断剂ICI182,780后毛蕊异黄酮对TGF-β1诱导的LX-2细胞中JAK2,p-JAK2,STAT3,p-STAT3的蛋白表达。结果:1.ERβ过表达慢病毒成功转染LX-2细胞,转染效率高。2.毛蕊异黄酮对LX-2细胞的安全作用浓度为25-200μM,对未经TGF-β1诱导的LX-2细胞增殖影响不明显。3.ERβ过表达和毛蕊异黄酮（200μM）均显著抑制了TGF-β1诱导的LX-2细胞的增殖、迁移和α-SMA蛋白表达（p<0.05）,且毛蕊异黄酮（200μM）对ERβ过表达的LX-2细胞比对未过表达LX-2细胞在抑制增殖、迁移和α-SMA蛋白表达上的能力更强（p<0.05）。4.ERβ过表达和毛蕊异黄酮（200μM）显著抑制了TGF-β1诱导的LX-2细胞中Col-Ⅰ、TIMP1蛋白表达,升高了MMP1蛋白表达（p<0.05）,且毛蕊异黄酮对过表达LX-2细胞较未过表达LX-2细胞在COL-Ⅰ,TIMP1和MMP1蛋白表达上的影响增强（p<0.05）。5.在ERβ过/未过表达LX-2细胞中,毛蕊异黄酮对JAK2总蛋白、p-JAK2、STAT3总蛋白的表达均无明显影响。值得注意的是,与模型组相比,ERβ过表达和毛蕊异黄酮（200μM）均能显著降低p-STAT3蛋白的表达,从而降低p-STAT3/STAT3比值;与未过表达LX-2细胞组相比,毛蕊异黄酮在过表达LX-2细胞中显示出p-STAT3/STAT3比值显著降低（p<0.01）,p-STAT3虽有所降低,但是未显示出显著差异。在LX-2细胞加用ICI182,780后,毛蕊异黄酮对p-STAT3蛋白的抑制作用得到显著逆转。结论:1.ERβ在LX-2细胞内参与抑制细胞增殖、迁移、活化及分泌胶原的细胞功能,其作用可能与抑制细胞内STAT3蛋白活化有关。2.ERβ介导了毛蕊异黄酮抑制LX-2细胞功能的作用,是该药物发挥抗肝纤维化活性的重要靶蛋白。3.毛蕊异黄酮抑制LX-2细胞功能的作用,与抑制细胞内STAT3蛋白活化有关。