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研究目的：人骨髓间充质干细胞(hMSCs)是位于骨髓基质中一类重要的干细胞群体,在细胞移植和基因治疗中具有多种功能。近来的研究表明骨髓移植病人体内的hMSCs来源于自身,这一临床上的发现提示龛位中的hMSCs可能耐受化疗药物的损伤作用,但是造成这一现象的确切机制目前还不清楚。研究内容：1.分离培养人Flk-1+hMSCs并从形态、表型、分化能力等方面鉴定其特性。2.分析了体外培养的Flk-1+ hMSCs对三种化疗药物cisplatin、vincristine、camptothecin处理后的反应。结果表明与敏感的肿瘤细胞系K562相比,体外培养Flk-1+ hMSCs对三种化疗药物有较高的耐受性；临床剂量的化疗药物处理后,细胞在表型、分化能力和衰老指标上没有改变。3.分析了凋亡诱导基因家族p53和p73的表达情况,结果表明与敏感的肿瘤细胞系K562相比,亚凋亡剂量化疗药物的处理导致Flk-1+ hMSCs内出现与凋亡诱导无关的p53表达增高；Flk-1+ hMSCs内p73的表达量明显低于K562细胞系,且药物的处理未能改变其表达水平。4.检测了外源过表达p73α蛋白后Flk-1+ hMSCs的损伤敏感性和损伤诱导的凋亡。结果表明逆转录病毒载体能介导Flk-1+ hMSCs中外源性p73α的表达,过表达p73α导致细胞对化疗药物cisplatin敏感性的显著增加,且p73α转染细胞中增加的化疗敏感性是由于细胞凋亡的增加。此外,实验还证明cisplatin和p73α能共同活化细胞中促凋亡因子Bax和p21。结论：1.体外培养的Flk-1+骨髓间充质干细胞能耐受多种化疗药物的促凋亡作用并在药物处理结束后仍保持其干细胞的特性。2.Flk-1+骨髓间充质干细胞的抗损伤状态可能与细胞内低水平的p73表达量有关,p73蛋白可能在骨髓间充质干细胞抗损伤调节中具有重要的作用。研究目的1.构建逆转录病毒载体,在原代培养的人脂肪源Flk-1+间充质干细胞(Adipose-derived mesenchymal stem cells)上介导高效、特异的RNAi。2.研究抑制p73蛋白的表达,对体外细胞向成骨、成脂肪和神经细胞方向分化的影响。研究方法1.针对p73基因编码序列,设计并合成RNA干扰短发夹寡聚核苷酸序列(short hairpin RNAi,shRNA),构建入逆转录病毒干扰载体骨架pSIREN-RetreQ;2.RT-PCR和western blot实验分别在(?)nRNA转录和蛋白翻译水平上证实,利用pSIREN-RetreQ载体能在脂肪源Flk-1+间充质干细胞中介导高效、特异地抑制p73的表达；3.流式细胞仪研究抑制p73的表达对人脂肪源Flk-1+间充质干细胞免疫表型影响；4.体外转染的脂肪源Flk-1+间充质干细胞向成骨和脂肪方向诱导,观察抑制p73的表达对其分化能力的影响；5.体外诱导脂肪源Flk-1+间充质干细胞神经细胞方向分化,观察抑制p73的表达对其向神经方向分化的影响。研究结果1.利用逆转录病毒载体pSIREN-RetreQ可以很好的介导p73干扰序列在人脂肪源Flk-1+间充质干细胞中高效、特异的抑制p73的表达；2.抑制p73的表达,对脂肪Flk-1+间充质干细胞的免疫表型以及成骨和成脂分化没有明显影响,但影响了细胞在体外向神经细胞方向分化的能力。结论1.逆转录病毒载体pSIREN-RetreQ可以作为研究人脂肪来源的Flk-1+成体干细胞中特殊基因功能的有力工具。2.p53家族蛋白成员p73在脂肪Flk-1+间充质干细胞体外向神经细胞方向的分化的过程中起重要的作用。