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褐飞虱(Nilaparvata lugns,BPH)是一种重要的水稻害虫。在实验室前期研究工作中,长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)分析发现,BPHOGS10005591-OT2跟褐飞虱繁殖力相关,葡糖脱氢酶(Glucose dehydrogenase,GLD)基因控制果蝇受精囊的存精能力,发现lncRNA基因BPHOGS10005591-OT2与GLD基因在基因组的位置上发生重叠,且表达具有相关性。本文进一步对lncRNA基因BPHOGS10005591-OT2和GLD基因进行了克隆,检测了基因表达,进行RNAi干扰分析等,对褐飞虱繁殖力分子机制的调控及昆虫lncRNA均具有重要的参考价值。1.lncRNA及其相邻蛋白编码基因的验证对褐飞虱12个不同转录组测序、预测及分析得到了 1882条lncRNA。为确定lncRNA的方向性,从中任选17条进行链特异性PCR验证。结果表明:17条中16条成功验证,其中,12条的转录方向为3’端,4条的转录方向为5’端,1条未扩增出目的条带。经预测得到了 BPHLNC-unc241基因有10个不同的转录本,为了确定BPHLNC-unc241基因是否发生选择性剪接,对10个转录本进行普通PCR验证。结果表明:4条无扩增结果,5条验证成功,BPHLNC-unc241-RJ不是目的条带。表明BPHLNC-unc24l 发生选择性剪接。lncRNA的表达分析发现,3条lncRNA在褐飞虱繁殖力和致害性种群中特异性表达,且和邻近的三条蛋白编码基因重叠。采用引物交叉互换PCR验证,结果表明:BPHOGS10005591-OT2和BPHOGS10007976-OT分别与之邻近的蛋白编码基因互相交换引物后不出带,说明这几个基因是独立的转录本。而BHHOGS10035598-OT的上游引物和与之重叠的蛋白编码基因下游引物组合后出带,可能是因为发生了选择性剪接,具体原因尚未知晓。2.三条lncRNA和与之重叠的三个蛋白编码基因的克隆三条长链非编码RNA(BPHOGS10005591-OT2,BPHOGS10007976-OT,BHHOGS10035598-OT)转录本与繁殖力密切相关的三个蛋白质基因,glucose dehydrogenase(GLD),gastrulation-defective(gd),N-acetylgalactosaminyltransferase7(GALNT7)发生重叠,通过primer5.0设计引物后,用RACE技术克隆了这六条基因的序列,结果表明:GLD基因的全长序列为2540nt,GALNT7的全长序列为2733nt,BPHOGS10007976-OT扩增后的长良为 2143nt,BHHOGS10035598-OT扩增后的长良为1365nt,为后续基因敲除打下基础。3.表达谱分析本章通过实时荧光定量PCR检测了褐飞虱在成虫不同日龄的相对表达量。结果表明:GLD基因在褐飞虱雌虫和雄虫各日龄的表达量都较高。而BPHOGS1000591-OT2在褐飞虱雌虫和雄虫中各日龄表达量趋势明显不同。在雌虫中,前期表达量高,后期表达量较低。而在雄虫中,前期表达量较低,最后三日龄表达量较高。但GLD和BPHOGS10005591-OT2的整体变化趋势是一致的。曾有报道GLD基因参与调控果蝇雌虫的储精能力,推测认为BPHOGS10005591-OT2可能参与褐飞虱的生殖发育。4.注射干扰GLD基因是调控果蝇储精能力的重要因子,本章通过体外合成siRNA干扰GLD和BPHOGS10005591-OT2来研究其对褐飞虱功能的影响,分别对褐飞虱一日龄雌虫注射1OOng的siRNA,24h后与雄虫交配,观察后代的数量情况。并在24h,48h及72h后每个样品收取三个重复做表达量分析。结果表明,GLD基因的定量分析结果有差异,BPHOGS10005591-OT2基因的定量分析结果与预期相反,观察后代数量有的注射组差异明显,但有的注射组没有差异,数据不稳定。