目前PM2.5己经成为我国大气污染的首要污染物,它可以在肺部深处沉积,通过血液循环进入人体多脏器体系,从而导致广泛的健康效应。柴油尾气颗粒(dieselexhaustparticles,DEP)是机动车尾气PM2.5最大的单一来源,2013年世界卫生组织将DEP定义为Ⅰ级致癌物。暴露于DEP与呼吸系统疾病及肺癌的发生密切相关,尽管已有大量关于DEP对人体健康影响研究,但DEP与呼吸系统疾病发生之间的分子机制仍不清楚。E2F转录因子家族是细胞内重要的调控蛋白,E2F1可以激活DNA合成并诱导静止期细胞进入S期,这是细胞凋亡、免疫反应和慢性炎症发生的关键。本研究对A549细胞暴露于DEP后,E2F1及其靶基因的调控作用开展相关研究,分别从细胞水平和动物水平探索E2F1参与DEP诱导肺损伤靶基因调控过程中的分子机制,为DEP导致的细胞毒性相关机制提供理论依据和线索。一、DEP暴露对肺泡上皮细胞转录组表达谱的影响1.A549细胞暴露于50μg/mL DEP 24 h,采用表达谱芯片技术检测A549细胞mRNA及蛋白表达谱的改变。经生物信息学分析筛选出mRNA水平差异表达基因共8000个,其中上调2512个,下调5488个(FC≥2且P<0.05);蛋白水平差异表达基因共254个,其中上调167个,下调87个(FC≥2);其中mRNA及蛋白水平表达趋势相同的差异表达基因共55个,上调14个,下调41个(FC≥2且P<0.05)。采用转录因子-基因调控网络分析,根据转录因子调控差异表达基因富集数进行排序,位居前五的转录因子分别为FLI1、HNF4A、GABP、XPN2及E2F1。其中转录因子E2F1调控相关靶基因 14 个,包括:NXT1、DDX46、PPIG、DDX17、NUDT21、NXF1、DKC1、MBNL1、YTHDC1、PABPN1、UPF3B、PIN4、NONO 及 FILIP1。利用 Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery(DAVID)6.7在线基因注释系统以及Gene Ontology(GO)进行分析,对E2F1调控差异表达基因进行功能富集分类。结果显示:E2F1调控14个靶基因主要参与RNA加工,RNA剪接,mRNA加工,mRNA代谢过程及RNA转运过程。2.A549 细胞分别暴露于 0 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL DEP 24 h,应用 qRT-PCR 技术,对表达谱芯片结果进行验证。50μg/mL、100μg/mLDEP剂量组中E2F1mRNA表达水平显著下调(P<0.05),50 μg/mL剂量组E2F1 mRNA表达水平比100 μg/mL剂量组低。E2F1调控相关靶基因(PPIG、DDX7、NUDT21、NXF1、DKC1、MBNL1、PABPN1、NONO、FILIP1)mRNA 调趋势与 E2F1一致,qRT-PCR结果与表达谱芯片结果存在良好的一致性。因此,DEP暴露可引起A549细胞转录组表达谱的改变,并导致E2F1调控相关基因mRNA表达水平下调,提示转录因子E2F1在DEP诱导肺组织损伤过程中可能发挥重要作用。二、E2F1调控DEP诱导肺泡上皮细胞的毒性作用为探讨E2F1在DEP诱导肺损伤过程中发挥的重要作用,首先在细胞水平分别从DEP暴露对A549细胞的毒性作用,E2F1调控DEP致A549细胞毒性作用机制两方面进行研究。1、DEP暴露对A549细胞的毒性作用1.1 CCK-8 比色法检测暴露于不同浓度 DEP(0、12.5、25、50、100、125 μg/mL)1、2、3、4、5、6、7天后对A549细胞活力的影响,结果显示与对照组相比,暴露于DEP后的A549细胞,细胞增殖活性显著降低(P<0.05),呈且剂量-反应关系。1.2观察暴露于DEP 24h后A549细胞形态变化。A549细胞分别暴露于0、12.5、25、50、100、125μg/mLDEP24h,与对照组相比,电子显微镜下观察不同DEP暴露组贴壁生长的细胞数均减少,细胞固缩呈圆形,伪足消失,透射电子显微镜下观察到DEP颗粒穿过细胞膜,进入A549细胞胞质,其中50、100μg/mL染毒剂量组死亡细胞数目增多,细胞膜出现崩解。1.3A549细胞分别暴露于0、12.5、25、50、100μg/mLDEP24h,采用流式细胞术检测DEP对A549细胞凋亡及细胞周期的影响。结果显示,与对照组相比,DEP染毒组的A549细胞凋亡率增加,随着染毒浓度的增加,细胞凋亡率逐渐升高,并且100μg/mLDEP剂量组的A549细胞死亡率显著增加(P<0.05)。细胞周期结果显示,暴露于DEP的A549细胞主要阻滞于S期和G2/M期(P<0.05)。2、E2F1调控DEP诱导的A549细胞毒性作用机制2.1 pcDNA-3.1-空载质粒和 pcDNA-3.1-E2F1-His 质粒转染 A549 细胞 48h,利用 qRT-PCR、Western Blot分别检测A549细胞中E2F1 mRNA及蛋白表达水平。结果显示:与转染空载质粒组相比,E2F1质粒转染后,E2F1 mRNA表达水平显著增加(P<0.05),同时Western Blot结果显示E2F1蛋白表达水平显著增加(P<0.05)。证明E2F1过表达A549细胞株构建成功。2.2 E2F1基因过表达的A549细胞暴露于50μg/mL DEP 24 h,流式细胞术分别检测E2F1在DEP诱导的A549细胞凋亡及细胞周期中的调控作用。结果显示,与空载质粒染毒组相比E2F1过表达能够显著降低DEP诱导A549细胞凋亡及死亡率(P<0.05),同时缓解DEP暴露对A549细胞S期和G2/M期的阻滞作用(P<0.05)。2.3 E2F1基因过表达的A549细胞经0、25、50μg/mL DEP暴露24 h,利用qRT-PCR及Western Blot分别检测E2F1过表达对DEP暴露诱导靶基因(PPIG、NXF1、NUDT21、DKC1、MBNL1、PABPN1、NONO及FILIP1)mRNA及蛋白表达水平的影响。结果显示,与空载质粒染毒组相比,E2F1过表达染毒组的NUDT21、PABPN1、PIN4、NXF1及NXT1 mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。Western Blot结果显示,PABPN1蛋白表达水平显著降低(P<0.05);E2F1过表达A549细胞经0、25、50μg/mL DEP暴露24h后,与空载质粒染毒组相比,PABPN1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。由此可知,DEP暴露可引起A549细胞E2F1靶基因mRNA及蛋白表达水平下调,改变细胞凋亡及细胞周期生物过程,影响A549细胞的增殖活性。过表达E2F1使DEP诱导相关靶基因mRNA及蛋白表达水平的下调,部分回复到正常水平,同时降低暴露于DEP引起的A549细胞凋亡,缓解细胞周期的阻滞作用。提示在DEP暴露诱导肺泡上皮细胞A549产生细胞毒性过程中E2F1可能发挥重要的调节功能。三、转基因小鼠染毒模型构建构建E2F1Tg/Tg过表达转基因小鼠,建立DEP气管滴注小鼠染毒模型1、E2F1Tg/Tg转基因小鼠构建E2F1Tg/Tg转基因小鼠由广州赛业生物科技有限公司根据Tet-on系统构建,转基因小鼠繁殖后,提取鼠尾组织DNA,经PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳鉴定转入组织特异性表达载体Cre,E2F1和携带Tet3G的载体质粒转基因小鼠。当Cre,E2F1,Tet3G同时表达为阳性时,鉴定为阳性转基因小鼠。2、DEP气管滴注小鼠染毒模型的建立E2F1Tg/rg转基因小鼠给予强力霉素喂养(喂养浓度为2 mg/mL)诱导转基因小鼠体内E2F1过表达。将转基因小鼠分为①E2F1Tg/Tg对照组②E2F1Tg/Tg&DEP染毒组③E2F1+/+对照组④E2F1+/+&DEP染毒组,同时进行DEP气管滴注染毒。四、DEP暴露的体内毒性及E2F1调控作用研究根据构建的转基因小鼠染毒模型,探讨DEP暴露的体内毒性及E2F1的调控作用。1、气管滴注DEP染毒体内一般毒性研究1.1通过组织整体观及常规病理染色方法,观察各组小鼠脏器病理改变情况。结果显示,DEP暴露后的小鼠肺组织出现DEP沉积。与E2F1+/+&DEP染毒组相比,E2F1Tg/Tg&DEP染毒组小鼠出现肺叶萎缩并有灰白色赘生物;肺组织病理HE染色结果显示,DEP暴露后小鼠肺组织出现不同程度的病理改变,包括出血、肺泡壁增厚断裂、肺组织不典型增生,周围肺泡实变,伴有大量炎细胞浸润等。肺组织病理损伤评分结果显示,与E2F1Tg/Tg对照组相比,DEP暴露组评分显著升高(P<0.05),E2F1+/+&DEP染毒组小鼠评分比E2F1Tg/Tg&DEP单纯暴露组有所降低;肝组织病理HE染色结果显示,DEP暴露后的小鼠肝组织出现肝细胞体积增大,肝索结构消失,胞质疏松,出现核溶解,肝窦内有大量炎性细胞浸润,肝小叶内炎细胞成灶性积聚等。3.2应用qRT-PCR及免疫组织化学染色法,检测经DEP暴露后小鼠肺组织中E2F1调控相关基因的表达水平。结果显示:气管滴注DEP小鼠染毒模型中E2F1调控相关靶基因mRNA表达水平发生了改变。与E2F1Tg/Tg对照组相比,E2F1Tg/Tg&DEP染毒组小鼠肺组织中PABPN1、NXF1、PIN4、DDX17基因mRNA表达水平显著降低(P<0.05);E2F1+/+&DEP染毒组小鼠随着转录因子E2F1表达水平的升高,E2F1所调控的靶基因PABPN1、NXF1。PIN4、DDX17 mRNA表达水平部分回复到正常水平,且与E2F1Tg/Tg&DEP染毒组存在统计学差异(P<0.05);免疫组化结果显示,DEP染毒组小鼠肺组织中E2F1免疫组化评分显著降低(P<0.05),E2F1+/+小鼠肺组织中E2F1、PANPN1免疫组化评分与E2F1Tg/Tg相比显著增加(P<0.05)。综上,气管滴注DEP染毒可导致小鼠肺损伤,发生病理性改变,肺组织中相关基因表达水平下调,转录因子E2F1可对下调基因起到回复调控的作用。提示转录因子E2F1在DEP暴露引起小鼠产生肺损伤过程中发挥重要调控作用。