论文部分内容阅读
目的将携带人白细胞介素-10 (human interleukin-10, hIL-10)基因的真核表达质粒经尾静脉高压注射的方法导入大鼠体内,探讨hIL-10基因治疗对去卵巢大鼠骨代谢及种植体骨结合的影响,为hIL-10基因治疗骨代谢性疾病及促进种植体骨结合奠定基础。方法1.扩增、鉴定携带hIL-10基因的质粒EX-A0007-M03,利用脂质体将其转入293T及RAW264.7细胞;荧光显微镜及ELISA检测目的基因的表达,破骨细胞形成及骨吸收实验鉴定hIL-10蛋白的生物学功能。2.以hIL-10为报告基因,通过尾静脉高压注射的方法将hIL-10质粒导入大鼠体内,观察不同注射条件对hIL-10在体内表达的影响,通过冰冻切片、ELISA及免疫组化等方法验证目的基因的表达。3.切除3月龄雌性SD大鼠双侧卵巢建立绝经后骨质疏松症模型,通过体重监测、子宫病理、血清ALP、Ca、P浓度、双能X线、骨组织病理及生物力学检测等方法验证绝经后骨质疏松症模型建立成功。4.在大鼠绝经后骨质疏松症模型建立成功的基础上,每周经尾静脉高压注射导入hIL-10质粒,于2w、4w、8w处死动物,通过体重监测、血清ALP、Ca、P、TRAP、IL-1β浓度、双能X线、骨组织病理及生物力学检测等方法观察hIL-10基因治疗对骨质疏松症大鼠骨代谢的影响。5.大鼠绝经后骨质疏松症模型建立成功后在其胫骨植入纯钛种植体,每周经尾静脉高压注射导入hIL-10质粒,于2w、4w、8w处死动物,通过X线、显微CT、制作带种植体硬组织磨片等方法观察hIL-10基因治疗对骨质疏松症大鼠种植体骨结合的影响。结果1.凝胶电泳和DNA测序鉴定证实EX-A0007-M03上携带的外源基因为hIL-10;EX-A0007-M03脂质体法瞬时转染293T及RAW264.7细胞获得成功,部分细胞发出绿色荧光,ELISA检测表明目的基因获得表达,转染后产生的hIL-10蛋白在体外具有抑制破骨细胞形成和骨吸收的生物学功能。2.冰冻切片、ELISA和免疫组化检测表明经尾静脉高压注射后hIL-10在大鼠体内得到高效的表达。3.去卵巢后12w大鼠体重较SHAM组明显增加,子宫萎缩,骨量丢失明显,血清ALP浓度升高,骨力学性能减退,呈现高转换型骨质疏松状态。4. hIL-10基因治疗可抑制OVX所致的TNF-α和TRAP 5b的升高(P<0.05),但对骨质疏松症大鼠和正常大鼠的骨代谢无明显影响。5. hIL-10基因治疗对骨质疏松症大鼠和正常大鼠的骨结合无显著性差异(P>0.05)。结论1. hIL-10质粒经转染后在体外具有抑制破骨细胞形成及骨吸收的生物学作用。2.尾静脉高压注射法可以使hIL-10基因在大鼠体内简单、安全、有效地得以表达。3. 3月龄雌性SD大鼠切除双侧卵巢后12w可以较好地模拟绝经后骨质疏松症。4. hIL-10基因治疗对骨质疏松症大鼠骨代谢及种植体骨结合无明显影响;IL-10对骨代谢性疾病的作用尚需要进一步的研究。