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目的:探究以HER2/neu抗原为靶点的Her2-CAR-T细胞治疗中晚期胃癌的潜能。同时,为改善肿瘤免疫抑制微环境,制备以Her2-CAR-T细胞为载体携载持续分泌IL-12（Her2-PB-IL12-CAR-T）或Her2/neu抗原刺激诱导表达IL-12细胞因子（Her2-NFAT-IL12-CAR-T）的“货车”CAR-T细胞。携载IL-12的“货车”CAR-T细胞通过在肿瘤局部释放高浓度IL-12以改善免疫微环境,从而进一步提高Her2-CAR-T细胞治疗中晚期胃癌的潜能。本课题通过体内、外实验研究以期获得Her2-CAR-T细胞以及同时携载IL-12治疗中晚期胃癌的有效性及安全性临床前数据,为后续开展临床研究提供重要实验依据。方法:（1）载体的构建和CAR-T细胞的转导及体外扩增。完成以Piggy Bac转座子为转导系统的可持续分泌和抗原诱导表达分泌IL-12的载体的构建及测序验证,同时完成基于转座子为转导系统的Her2-CAR质粒的测序验证及扩增（Her2-CAR受赠于上海科技大学黄行许教授）。通过电转技术及T细胞体外扩增,获得三种不同的CAR-T细胞,分别为Her2-CAR-T细胞,持续表达IL-12的HER2-PB-IL12-CAR-T细胞、Her2抗原特异诱导表达IL-12的HER2-NFAT-IL12-CAR-T细胞,以及未电转平行扩增的NT细胞。电转次日,利用流式技术检测质粒的电转效率;此后,每2-3天细胞换液,5-7天对扩增的T细胞计数,绘制细胞增值曲线。利用流式检测体外扩增第14,21-28天扩增的T细胞CD3+,CD4+,CD8+等免疫表型以及CAR的阳性率;（2）靶细胞的筛选及过表达Luciferase稳转细胞的获得。通过流式检测胃癌细胞系NCI-N87、AGS、HGC-27以及SGC-7901细胞的HER2表达强度,确定HER2阳性以及阴性细胞系。选取HER2强阳性细胞株NCI-N87转导Luciferase表达质粒,通过G418持续筛选获得稳定表达Luciferase胃癌细胞株NCI-N87-Luc+,该细胞将用作靶细胞完成后续CAR-T细胞的体内外功能实验研究;（3）体外实验研究。将四种效应细胞与HER2+靶细胞按不同效靶比（10:1、5:1、2.5:1、1.25:1）共孵育4h以及24h后,检测不同CAR-T细胞及NT细胞对肿瘤细胞的杀伤能力;将效应细胞与胃癌靶细胞按2:1的比例共孵育24h,收集上清。流式检测上清中的细胞因子（IL-2、IL4、IL6、IL10、IFN-γ、TNF-α）分泌情况、ELISA检测IL-12的分泌情况;（3）体内实验研究。完成胃癌裸鼠模型的构建及CAR-T细胞治疗研究。择5周龄的雌性BALB/c-nu/nu裸鼠以5×10~6/只剂量皮下注射NCI-N87-Luc+,待肿瘤长至200mm~3左右以1×10~6/只剂量的CAR-T细胞连续两次瘤内注射,间隔时间为5天。之后,每5天进行小动物活体成像检测生物发光信号变化。每3-4天测量小鼠体重变化,通过游标卡尺测量肿瘤生长情况并绘制曲线,在免疫细胞治疗27天后处死小鼠,进行肿瘤剥离、称重。结果:（1）成功构建基于Piggy Bac转座子系统能在T细胞中持续表达和抗原特异诱导表达,具有生物学功能的IL-12表达载体;（2）应用流式细胞技术检测胃癌细胞系的HER2抗原表达情况。结果显示,不同胃癌细胞Her2抗原表达强度差异显著,其中,NCI-N87为Her2强表达细胞株。通过转导、筛选,获得稳定过表达Luciferase的NCI-N87-Luc+细胞;（3）成功制备Her2-CAR-T细胞,携载IL-12细胞因子的“货车”Her2-PB-IL12-CAR-T细胞,Her2-NFAT-IL12-CAR-T细胞以及NT细胞;（4）CAR-T细胞体外功能实验研究显示,相对于单纯的HER2-CAR-T细胞,携载IL-12的两种Her2-CAR-T细胞对胃癌细胞具有更强的杀伤能力。在Her2抗原刺激下,诱导表达IL-12的HE2-NFAT-IL-12所表现出的杀伤活性不逊于持续分泌IL-12的HER2-PB-IL12细胞。细胞因子检测表明与HER2-CAR-T相比,携载IL-12的CAR-T细胞可以分泌更多的与细胞杀伤有关的IL-2、TFN-α、IFN-γ等细胞因子;（5）成功构建了小鼠胃癌模型并初步完成CAR-T细胞治疗研究。体内实验表明Her2-CAR-T细胞对胃癌细胞生长具有显著的抑瘤效果;携载IL-12的Her2-PB-IL12-CAR-T细胞及Her2-NFAT-IL12-CAR-T细胞较Her2-CAR-T在动物体内显示更强的抗瘤活性。三种CAR-T细胞对小鼠均显示较好的安全性。结论:1.构建靶向Her2抗原的Her2-CAR-T细胞及携载IL-12的Her2-CAR-T细胞对Her2+胃癌细胞NCI-N87具有较好的抑瘤能力及安全性。2.本研究中构建的HER2-NFAT-IL12-CAR-T与HER2-PB-IL12-CAR-T细胞体内、外数据显示其抑瘤效果显著优于HER2-CAR-T细胞,由于HER2-NFAT-IL12-CAR-T细胞所分泌的IL-12为抗原特异诱导产生,故相较于直接分泌IL-12的HER2-PB-IL12-CAR-T细胞更加安全。