目的:胆总管结石为胆道外科常见疾病,轻者可无明显症状,重者可进一步发展,堵塞胆管,造成梗阻性黄疸。随着腹腔镜技术的开展,腹腔镜胆总管探查取石术(LCBDE)已经成为胆总管结石的主要治疗方式。术后胆道引流可解除胆道梗阻,降低胆道压力,减轻炎性胆汁反流,促进局部炎症消退等,但其仍存在不可忽视的并发症。梗阻性黄疸和胆汁引流后均可造成肠道内胆汁缺乏,可导致肠黏膜屏障功能的破坏,细菌和内毒素移位,引起菌血症和内毒素血症,诱导促炎细胞因子的产生(TNF-α,IL-6),诱发全身性炎症反应综合征,可能导致多器官功能障碍综合征。肠上皮屏障主要包括机械屏障、化学屏障、生物屏障和免疫屏障。其中机械屏障是肠上皮屏障最重要的一道防线。机械屏障主要由上皮细胞和细胞间紧密连接(TJs)构成。紧密连接是一组跨膜蛋白,水闸蛋白(Claudins)、闭锁蛋白(Occludin)和膜内闭锁小带蛋白(ZOs)以及邻近的粘附连接(E-cadherin)组成,它们通过与邻近细胞相互作用形成选择性屏障。研究表明维生素D可通过激活维生素D受体(VDR)维护肠黏膜屏障功能。维生素D受体同时也是胆汁酸的感应器,胆汁中石胆酸(LCA)是维生素D受体的激活剂,石胆酸激活的维生素D受体在调节胆汁酸代谢和促进石胆酸解毒代谢中发挥重要作用。但石胆酸激活维生素D受体后对肠黏膜屏障功能的影响至今尚未见相关报道。沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)可以使核因子E2相关因子2转录因子(Nrf2)和核因子κB(NF-κB)去乙酰化,从而影响氧化应激和炎症反应等生理功能。当Nrf2激活后从胞浆转移到细胞核内,介导靶基因(如血红素氧合酶-1和超氧化物歧化酶1)的转录。本研究主要是为了探讨石胆酸对肠黏膜屏障功能的影响,及维生素D受体在石胆酸调节肠黏膜屏障功能中的作用,并进一步明确石胆酸对SIRT1/Nrf2信号通路和NF-κB信号通路的影响。研究方法:第一部分:研究对象为周龄在8-10周之间SPF级Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠。SD大鼠适应性饲养一周后,将30只SD大鼠按随机数字表法分为三组:假手术组(SH组)、胆汁外引流组(ED组)、梗阻性黄疸组(OJ组)。建模7天后处死动物,留取标本。检测方法:记录大鼠一般状态及体重变化。HE染色和电镜检测大鼠肠黏膜形态学和超微结构变化。FITC-dextran检测大鼠肠黏膜通透性改变。同时检测大鼠肠黏膜氧化应激指标丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)的变化。Western blot检测大鼠肠黏膜VDR蛋白和紧密连接蛋白(ZO-1、E-cadherin、Occludin、Claudin-1)的表达变化。第二部分:研究对象为周龄在8-10周之间SPF级Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠。SD大鼠适应性饲养一周后,将50只SD大鼠按随机数字表法分为五组:假手术组(SH组)、胆汁外引流组(ED组)、胆汁外引流+石胆酸组(ED+30mg/kg LCA组)、梗阻性黄疸组(OJ组)、梗阻性黄疸+石胆酸组(OJ+30mg/kg LCA组)。建模7天后处死动物,留取标本。检测方法:记录大鼠一般状态及体重变化。HE染色和电镜检测大鼠肠黏膜形态学和超微结构变化。FITC-dextran检测大鼠肠黏膜通透性变化。同时检测大鼠肠黏膜氧化应激指标丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)的含量变化。免疫组化和Western blot检测大鼠肠黏膜VDR蛋白和紧密连接蛋白(ZO-1、E-cadherin、Occludin、Claudin-1)的表达和分布。免疫组化检测大鼠肠黏膜VDR和ZO-1蛋白的表达和分布。第三部分:Caco-2细胞模型是一种人克隆结肠腺癌细胞,结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞,具有微绒毛等结构。因此我们选择Caco-2细胞体外建立单层细胞屏障模型。检测方法:(1)CCK-8检测不同浓度的LCA(5、10、20、50μM)对Caco-2细胞活力的影响。(2)Western blot检测不同浓度LCA(5、10、20、50μM)干预Caco-2单层细胞不同时间(3、6、12、24h)后VDR蛋白的表达变化,筛选出LCA处理细胞的最佳时间和剂量。(3)不同浓度LCA(5、10、20、50μM)和TNF-a(100ng/m L)处理Caco-2单层细胞后,通过跨上皮细胞电阻(TEER)和FITC-dextran检测Caco-2单层细胞屏障通透性的变化;Western blot检测Caco-2单层细胞紧密连接蛋白(ZO-1、E-cadherin、Occludin、Claudin-1)的表达变化。(4)LCA(20μM)和TNF-a(100ng/m L)处理Caco-2单层细胞24h后,检测氧化应激指标MDA、ROS、SOD、GSH的变化;Western blot检测Caco-2单层细胞后SIRT1、Nrf2、HO-1和NF-κB信号通路的变化;免疫荧光检测紧密连接蛋白、Nrf2和NF-κB p-p65定位。(5)给予Caco-2细胞SIRT1抑制剂EX527预处理3h后,再给予LCA(20μM)和TNF-a(100ng/mL)处理Caco-2单层细胞,Western blot检测紧密连接蛋白、SIRT1/Nrf2信号通路和NF-κB信号通路的变化。(6)慢病毒构建敲减VDR的稳转Caco-2细胞系,给予LCA(20μM)和TNF-a(100ng/mL)处理Caco-2单层细胞,Western blot检测紧密连接蛋白、SIRT1/Nrf2信号通路和NF-κB信号通路的变化。结果:第一部分:(1)和假手术组相比,胆汁外引流组大鼠可见大量清亮胆汁自引流管引出,毛发粗糙无光泽,活动少,颈部引流管皮肤有溃烂现象,食欲差,体重增加不明显,部分大鼠明显消瘦。胆汁外引流组大鼠肠黏膜完整性破坏,肠绒毛短缩、稀疏,其肠绒毛高度、黏膜厚度、隐窝深度均减低。胆汁外引流组大鼠血清中FITC-dextran含量升高,肠黏膜均浆中MDA、ROS含量升高,SOD、GSH的含量下降,肠黏膜VDR蛋白和紧密连接蛋白ZO-1、E-cadherin、Occludin、Claudin-1蛋白均下调。(2)和假手术组相比,梗阻性黄疸组大鼠皮肤、尿液明显发黄,近心端胆管膨大,肝脏肿大黄染,部分大鼠肝脏表面可见颗粒结节。毛发粗乱无光泽,活动减少,食欲差,体重增加缓慢,但无体重明显减轻。梗阻性黄疸组大鼠肠黏膜完整性破坏,肠绒毛短缩、稀疏,其肠绒毛高度、黏膜厚度、隐窝深度较假手术组均明显下降。梗阻性黄疸组大鼠血清中FITC-dextran含量明显升高,肠黏膜均浆中MDA、ROS含量升高,SOD、GSH含量下降,肠黏膜VDR蛋白和紧密连接蛋白ZO-1、E-cadherin、Occludin、Claudin-1蛋白均下调。第二部分:(1)和单纯胆汁外引流组比较,建立胆汁外引流同时给予30mg/kg石胆酸灌胃组大鼠一般情况并无明显改善,且体重较假手术组明显减轻;给予石胆酸灌胃组大鼠肠黏膜形态有所改善,黏膜微绒毛密集、排列整齐,肠绒毛高度增加,但黏膜厚度、隐窝深度并无明显改善。给予石胆酸灌胃组大鼠血清中FITC-dextran含量减少,肠黏膜匀浆中MDA、ROS的含量降低,SOD、GSH的含量增加,肠黏膜VDR、ZO-1、E-cadherin、Occludin、Claudin-1蛋白表达均增加。(2)和单纯梗阻性黄疸组比较,建立梗阻性黄疸同时给予30mg/kg石胆酸灌胃组大鼠一般情况并无明显改善,体重亦无明显增加。给予石胆酸灌胃组大鼠肠黏膜形态有所改善,黏膜微绒毛密集、排列整齐,肠绒毛高度、隐窝深度增加,但黏膜厚度并无明显改善。给予石胆酸灌胃组大鼠血清中FITC-dextran含量减少;肠黏膜匀浆中MDA、ROS含量减低,SOD、GSH的含量增加,肠黏膜VDR、ZO-1、E-cadherin、Occludin、Claudin-1蛋白表达均增加。第三部分:(1)CCK-8结果表明,用0-50μM LCA处理细胞24h,LCA对细胞活力没有影响。(2)LCA以剂量依赖性的方式缓解TNF-α诱导的细胞屏障通透性的增加。(3)LCA以时间依赖性和剂量依赖性的方式促进VDR蛋白表达。(4)LCA通过剂量依赖性的方式缓解TNF-α诱导的Caco-2细胞紧密连接蛋白ZO-1、E-cadherin、Occludin、Claudin-1表达下调。(5)免疫荧光结果显示,TNF-α处理Caco-2单层细胞后,细胞紧密连接蛋白出现锯齿状突起,其分布不规则且不连续。然而LCA干预细胞后明显改善了TNF-α诱导的紧密连接蛋白分布改变和破坏。(6)与TNF-α组相比,LCA治疗显著增加了SIRT1、Nrf2和HO-1蛋白的表达水平并抑制了TNF-α介导的Caco-2单层细胞NF-κB p-p65和p-IκB-α的上调。免疫荧光结果显示,与TNF-α组相比,LCA处理显著诱导Nrf2活化并向细胞核内转移。同时LCA有效抑制TNF-α诱导的NF-κB p65向细胞核的转运。(7)SIRT1抑制剂EX527部分抑制了LCA诱导的紧密连接蛋白和SIRT1、Nrf2和HO-1表达增加。EX-527同时促进了NF-κB p-p65和p-IκB-α的表达。(8)敲减Caco-2细胞后,LCA上调紧密连接蛋白、SIRT1、Nrf2、HO-1表达和抑制NF-κB p-p65、p-IκB-α表达作用完全消失。结论:(1)肠道内胆汁缺失可导致肠绒毛萎缩,肠黏膜炎性细胞浸润,肠黏膜通透性增加,紧密连接蛋白表达下调,肠黏膜屏障功能破坏。(2)肠道内胆汁缺乏可导致脂质过氧化,抗氧化剂含量下降,抗氧化能力减弱。(3)肠道内胆汁缺乏可降低VDR蛋白的表达。(4)LCA可改善肠道内胆汁缺失对肠黏膜通透性增加和紧密连接蛋白的破坏,维护肠黏膜屏障完整。(5)LCA可缓解肠道内胆汁缺乏导致的脂质过氧化,增强抗氧化能力。(6)LCA可增加肠道内胆汁缺失大鼠VDR蛋白的表达。(7)LCA可改善TNF-α诱导的Caco-2单层细胞屏障通透性增加和紧密连接蛋白结构的破坏。(8)LCA可通过激活VDR进一步激活SIRT1/Nrf2和抑制NF-κB信号通路维持肠黏膜屏障功能的完整。