一氧化氮（nitric oxide，NO）是一种无色、微溶于水、脂溶性较强的气体分子，在生物体内可以自由地通过生物膜，作为一种重要的生物活性分子，NO参与体内一系列生理和病理过程，相关研究显示NO具有抗肿瘤功效。硝酸甘油（glyceryl trinitrate，GTN）作为有机硝酸酯类扩血管药物已有百余年的应用史，近年的研究发现，GTN作为NO供体在体内可转化为NO，进而合成S-亚硝基硫醇（S-nitrosothiols，RSNO）或氧化为亚硝酸盐。利用GTN在体内代谢特性，本研究以细胞培养和动物实验模型，探索了GTN对肿瘤细胞生长繁殖的影响及其机制，结果显示其具有潜在的抗肿瘤功效。 1．GTN在细胞培养体系及动物体内经消化道吸收后代谢产生亚硝酸盐。将不同浓度的GTN加入1640培养液，放置于37℃ 5％CO₂孵箱中48h后加Griess试剂，于540 nm测亚硝酸盐。发现GTN浓度依赖性代谢产生亚硝酸盐。以实验兔为动物模型，应用电生理监测仪动态检测血压，血气分析仪检测高铁血红蛋白（Methemoglobin，MetHb），全自动生化分析仪检测丙氨酸氨基转移酶（Alanine transferase，ALT），比色法检测硝酸盐、亚硝酸盐、还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）。结果发现GTN经消化道吸收后代谢产生亚硝酸盐，并导致红细胞GSH降低，此代谢过程具有潜硕士学位论文在抑制肿瘤细胞生长效能。Me tHb、ALT未见明显变化，说明GTN在代谢过程中未导致明显肝脏功能损伤.2.GTN可有效抑制肿瘤细胞的生长繁殖，并导致肿瘤细胞生长周期改变.取对数分裂期的人宫颈癌细胞株（human cervicalearcinoma ce一line，Hela）细胞，用0.125%的胰蛋白酶消化处理进行细胞计数、加入%孔板，调节细胞数为3 xl少/孔.分别加入不同浓度的GTN.将%孔板放置于37℃，5%C02孵箱中培养48h后，取上清液测亚硝酸盐，以四甲基偶氮吐蓝（3一（4，5一d imethylthiazol一2一yl）一2，5一dyphenyltetrazoliumbromide，MTT）方法测细胞的生长活性。发现高浓度GTN可导致细胞不贴壁，并引起细胞死亡。MTT检测结果显示，高浓度GTN可明显抑制肿瘤细胞的生长。同时利用对数分裂期的He la细胞，在培养体系中加入1.75X10一恤GTN，48h后消化细胞，70%冷乙醇4℃固定，澳化乙吮（Ethidium bromide，EB）染色，用流式细胞仪检测细胞周期。结果显示GTN可改变肿瘤细胞周期各时相的分布，表现为GZ^M期细胞所占比例增加，S期细胞所占比例下降。3.GTN代谢可导致肿瘤细胞内GSH被氧化，抑制肿瘤细胞Bcl一2墓因蛋白表达和诱导肿瘤细胞凋亡.GSH的检测参照文献报道的二硫双硝基苯甲酸（2一nitr。benzoic，DTNB）法并加以改进。在培养体系中加入1.75X10一‘M GTN，48h后消化细胞，调整细胞浓度为3X10‘，离心弃上清，加1.67%偏磷酸沉淀剂150川，混匀，超速离心，取上清60林l加入96孔板，每孔加0.3M Na:Hpo;液200林1，0.04%DTNB液25川，混匀，用酶标仪405nm波长比色.GTN可引起肿瘤细胞的硕士学位论文GSH明显下降（P<0.05）。 在培养体系中加入1.75X10一俪GTN，48h后消化细胞，调整细胞浓度为10‘，按试剂盒操作说明加细胞破膜剂，稳定剂，FITc标记的抗人Bcl一2抗体，用流式细胞仪检测荧光指数。结果显示，GTN作用后的肿瘤细胞荧光指数下降，GTN可抑制B。1一2基因蛋白的表达。在培养体系中加入1.7sxlo一‘M eTN，48h后消化细胞，用^nnexinV联合碘化丙咤（Propidium Iodide，Pl）染色细胞，用流式细胞仪检测细胞凋亡指数（APoPt。5 1 5 index，.AI）。肿瘤细胞在GTN的作用下，细胞的凋亡指数明显增高（杯0.05），GTN可诱导细胞凋亡.4.动物实验证明GTN能够抑制小鼠移植性肿瘤的生长.将GTN灌胃处理后的5180肉瘤细胞接种到昆明小鼠腋窝皮下，用高低浓度的GTN灌胃后观察抑瘤率并检测小鼠血液的生化指标。结果显示GTN灌胃能明显抑制小鼠5 1 80实体瘤的生长，同时消耗GSH，使血糖浓度升高，尿素浓度下降。GTN对小鼠移植性肿瘤具有抑制作用，并提高荷瘤小鼠的生存质量.结论: 通过本系列研究表明，GTN作为N0供体，在生物体内代谢氧化还原性琉基，同时生成亚硝酸盐.此过程可通过抑制B。1一2基因的表达、诱导细胞凋亡、改变细胞周期等机制而抑制肿瘤细胞的生长繁殖，且动物实验证明其具有抑制5180实体瘤移植后生长的功效，具有潜在抗肿瘤功效.