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近年来,免疫检查点阻断疗法（ICB）在癌症治疗中受到广泛关注,其中以程序化死亡受体-1/细胞程序性死亡-配体1（PD-1/PD-L1）途径的免疫检查点阻断疗法为代表。在PD-1/PD-L1途径免疫阻断治疗中,PD-L1主要暴露于肿瘤细胞的表面,例如:黑色素瘤细胞,非小细胞肺癌细胞,肺癌和肠癌细胞等,PD-L1可以与T淋巴细胞表面的受体PD-1结合,使T细胞功能丧失,不能杀伤肿瘤细胞从而引起肿瘤细胞的免疫逃逸,促进肿瘤的发展。有研究表明,PD-1/PD-L1抑制剂可以有效促进辅助性T细胞（Ths）和细胞毒T淋巴细胞（CTLs）的增殖,增强T细胞的功能,增强免疫应答。虽然PD-1/PD-L1检查点抑制剂在治疗过程中有其独特的药理作用,但是由于免疫抑制,其ICB在很多肿瘤中响应率较低,存在一定的局限性。光动力疗法（PDT）是通过激光照射光敏剂（PSs）将氧气转化成活性氧（ROS）,例如单线态氧（1O2）,过氧化氢（H2O2）和羟基自由基（·OH）等杀死肿瘤细胞的一种治疗方法。研究发现PDT产生的活性氧可以引起肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡（ICD）,从而激活机体的抗肿瘤免疫应答,但是游离光敏剂药物存在水溶性差,靶向性低,以及在PDT过程中在肿瘤组织部位蓄积不足,治疗效果较差的问题。因此,光动力治疗虽然可以诱导一定程度的抗肿瘤免疫应答,但通常不足以抑制单纯光动力治疗后残留的肿瘤细胞的生长和转移。鉴于上述两种疗法的问题和优势,将光动力治疗和免疫检查点阻断疗法联合应用,利用光动力治疗产生的肿瘤抗原,诱导宿主发生抗肿瘤免疫应答,有望提高免疫检查点阻断疗法的治疗效率,抑制肿瘤转移。在目前对联合治疗的研究中,通常是瘤内注射免疫检查点阻断抗体。抗体药物的使用成本较高,并且免疫相关不良事件（irAEs）对纳米制剂中抗PD-L1抗体的精确装载提出了严格的要求。因为物理包封会不可避免地产生批次间差异,而化学修饰受抗体稳定性低的限制。为解决以上问题,我们提出了一种分子工程策略,利用抗PD-L1肽（APP）替代抗PD-L1抗体,开发出一种可精准控制PD-L1抑制剂含量的高效、低毒、经济的纳米平台。由于肿瘤微环境中基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的过度表达,通过MMP-2响应性的多肽序列作为连接链段,将PD-L1抑制性多肽和光敏剂连接起来,形成两亲性的分子（IR780-M-APP）。APP与光敏剂IR780通过MMP-2响应性多肽片段（PLGLAG）连接,以获得IR780-M-APP,其具备两亲性能够在水溶液中自组装形成纳米粒（NPs）的分子,APP负载量为48.4 wt%。具体来说,IR780-M-APPNPs中的IR780部分片段赋予该纳米粒光动力活性以及诱导ICD的能力,而APP部分片段可以阻断PD-1/PD-L1途径以促进免疫应答。IR780-M-APP可以在水溶液中自发组装形成纳米粒,到达肿瘤组织之后能够在组织中高浓度的MMP-2作用下精准地释放APP,APP与肿瘤细胞表面的PD-L1结合,阻断PD-1/PD-L1通路;剩余的片段组装成为尺度更小的纳米粒,增强光敏剂在肿瘤组织的穿透和肿瘤细胞的摄取。给予激光照射之后,可以诱导ICD,刺激T细胞活化增殖,增强PD-L1免疫抑制性多肽的免疫治疗效果。因此,我们构建的基于抗PD-L1多肽的光动力免疫治疗纳米平台不仅可以直接杀死原发性肿瘤,而且能有效根除转移性和侵入性肿瘤。分子工程策略为设计先进纳米平台用于癌症治疗提供了更多的机会。本课题的主要研究内容如下:1.IR780-M-APP NPs的制备与表征将光敏剂IR780与抗PD-L1多肽（APP）通过MMP-2响应性多肽序列共价连接起来,合成MMP-2响应性两亲性分子,即IR780-M-APP。利用反溶剂法成功制备IR780-M-APPNPs,并对该纳米粒的物理化学性质、体外光学活性、MMP-2响应性以及溶血率等进行了一系列研究。该纳米制剂为绿色溶液,核磁共振氢谱谱图（1H-NMR）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和紫外-可见分光光度计（UV-Vis）扫描结果证明了 IR780-M-APP的合成成功;透射电子显微镜（TEM）结果显示IR780-M-APP NPs呈均匀球形分布;动态光散射（DLS）显示该纳米粒的粒径大约在151.1 nm;体外活性氧实验证明IR780-M-APP NPs具有的良好的体外光动力活性。MMP-2预处理实验表明IR780-M-APP NPs具有较好的MMP-2响应性,MALDI-TOF-MS实验证实响应后两片段的分子量均符合理论值;TEM结果显示响应后含有光敏剂的一段会组装成粒度更小的纳米粒（34.12 nm）。2.IR780-M-APP NPs的体外细胞水平抗肿瘤研究利用B16F10细胞建立体外抗肿瘤细胞模型,在体外细胞水平上评估IR780-M-APP NPs的光动力-免疫联合治疗的抗肿瘤效果,并对其在免疫方面的作用进行了初步研究:体外细胞实验,纳米粒在MMP-2预处理的条件下,细胞摄取实验表明IR780-M-APPNPs摄取效果优于游离IR780;细胞毒性实验证明该纳米制剂在光照条件下对细胞具有较强的杀伤作用;细胞内ROS水平检测实验和凋亡实验结果表明IR780-M-APP NPs在光照条件下具备较强的光动力疗效且诱导了更为高效的细胞凋亡;细胞膜钙网蛋白（CRT）外翻实验证明该IR780-M-APPNPs可以引起强效的ICD;B16F10细胞表面PD-L1结合力实验表明基质金属蛋白酶2预处理的M-APP（MMP-2敏感键连接抗PD-L1肽）和IR780-M-APPNPs阻断免疫检查点PD-1/PD-L1具有相似的与PD-L1结合的作用,说明IR780的化学修饰对抗PD-L1肽的作用影响不大。3.IR780-M-APP NPs体内光动力治疗联合免疫治疗的抗肿瘤研究利用雌性C57BL/6小鼠建立B16F10黑色素瘤双边模型和肺转移模型,通过体内药物分布实验、双边抑瘤实验以及抗肺转移实验来研究IR780-M-APPNPs的体内抗肿瘤效果和免疫效应。其中体内药物分布实验验证了纳米粒在肿瘤部位的蓄积能力优于游离的IR780;双边抑瘤实验结果表明IR780-M-APP NPs+Laser可以有效的抑制原位肿瘤的生长,并且通过免疫效应对远位瘤有较好的抑制效果。IR780-M-APP NPs+Laser可以促进肿瘤部位的淋巴细胞浸润,并且可以有效地减少调节性T淋巴细胞（Tregs）,同时在治疗结束后我们检测了小鼠的脾脏中的辅助性效应T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、Tregs水平和血清细胞因子,证明了纳米粒有效的增强小鼠体内的抗肿瘤免疫应答;抗肺转移实验证明IR780-M-APP NPs可以有效地抑制肿瘤细胞的肺转移。综上所述,本课题通过构建了肿瘤微环境响应的IR780-M-APP两亲分子组装体,实现光敏剂和PD-L1抑制性多肽的同步递送及肿瘤微环境响应性释放,在通过光动力治疗消融原位肿瘤的同时可以增强体系的免疫原性,提高了抗PD-L1多肽的免疫应答效率,有效地抑制肿瘤肺转移,为有效解决肿瘤转移提供新的治疗思路,具有广阔的应用前景。