近年来,随着工农业的快速发展,大量危害动物生存环境和人类健康的化学品被释放到自然环境中。大量证据表明,空气、土壤和水域中许多化学污染物正在干扰野生动物和人类的正常生理活动。据报道,两栖动物种群数量在全球范围内正在急剧下降,其中人工合成化学物质对环境的污染是主要因素之一。两栖动物的繁殖和幼体发育在水环境中完成,水域化学污染物可能以致死剂量直接导致动物死亡,也可能通过亚致死剂量影响动物的代谢、免疫以及繁殖等机能。有机磷类杀虫剂(organophosphate insecticides,OPs)是继有机氯类被禁用后应用最为广泛的一类农药。它具有广谱、高效、残留期短以及使用成本低等特点,已成为当前主要的农药种类,占全球杀虫剂使用总量的70%以上。敌百虫(trichlorphon),化学名O,O-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羟基乙基)磷酸酯(C4H8O4C13P),是一种最常见的有机磷农药,被广泛用于害虫防治以及养殖动物体内外寄生虫的杀灭。在水产养殖中,敌百虫通常用于防治水生昆虫对养殖对象的感染以及体外的蠕虫寄生,也可用于控制水体中的浮游生物的过度繁殖。然而,长期反复的使用将形成敌百虫对水源的污染,可对鱼、蟹、虾类等非靶标生物中的有益种类产生直接或间接的毒性,进而对处于食物链顶端的高等动物及人类产生毒性作用。由于对靶标和非靶标动物的生长发育和内分泌活动均具有一定的负面干扰,敌百虫已被列为环境内分泌干扰物(environmental endocrine disruptors,EEDs)。敌百虫作为有机磷杀虫剂,是胆碱酯酶(cholinesterase,ChE)的抑制剂,主要通过抑制乙酰胆碱醋酶(acetylcholinesterase,AChE)的活性对动物产生神经毒性。但仅此并不能解释敌百虫对机体所产生的多种毒性效应,尤其是低剂量对非靶标动物产生的一系列影响。研究显示,将水生动物在低剂量敌百虫水体中暴露,可导致机体内一系列的生理生化变化,包括诱发机体的氧化应激过程、造成DNA损伤、导致遗传毒性等多种毒性效应,以及作为EEDs对动物生殖、发育、免疫和内分泌活动的干扰。这些效应主要包括对机体代谢和神经递质的影响,可导致细胞氧化损伤、细胞凋亡率上升以及神经系统某些功能紊乱。然而,低剂量敌百虫的毒性机制及其对细胞代谢活动的分子机制仍不清楚。从其产生的效应分析,敌百虫并非仅仅通过抑制AChE活性而发挥作用。所以,低剂量敌百虫的毒性机制及其潜在危害仍待深入探讨,它将为有机磷农药的规范使用和管理以及水域环境的治理提供重要的科学依据。两栖动物具有特殊的生命周期,其繁殖和幼体发育均在水域环境中,成体营水陆两栖生活。由于两栖动物的皮肤对水体中化学物质具有较高的渗透性,可导致潜在外源毒性物质进入机体蓄积或参与代谢,所以被认为是研究环境污染的理想模型,可作为检测水域化学污染有效的指标动物之一,其生态分布也可作为环境污染程度的指示种群。目前,有关水域中有机磷杀虫剂对两栖动物生长发育影响的报道仍然较少。中国林蛙(Rana chensinensis)是我国北方农林地区的广布种,在正常生活周期中对水质条件要求相对严格,对化学污染物的敏感性较强,是作为水域污染监测和水生毒理研究的理想动物模型。肝脏是动物代谢、解毒和参与免疫机能的重要器官。环境污染物若作为有毒物质进入动物机体,首先在肝组织内发生一系列的反应。水生动物的急性中毒是在短期内通过鳃、表皮、口腔等组织器官,摄入过量的有毒物质,大多是经血液运输到肝脏内被蓄积,导致肝功能障碍甚至肝细胞坏死,这一途径对动物的新陈代谢以至于生命活动造成直接的胁迫。有机磷类杀虫剂胁迫可诱发机体产生氧化应激,扰乱相应的酶活性,影响氧化代谢等生理过程,从而使得机体内的代谢发生改变。当机体氧化程度超出自身抗氧化能力,致使其氧化和抗氧化失衡,倾向于过氧化状态时,将产生氧化中间产物,最终导致组织损伤及病变。涉及机体抗氧化防御系统的酶包括:超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)及谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase,GST)等。SOD是机体应对氧化应激的第一层保护屏障,其活性变化可作为诱导氧化应激的生物标记。CAT作为抗氧化酶,其主要功能是保护机体抵御H202的损害,可将H2O2酶解为O2和H2O,降低活性氧的毒性。与此同时,GST是生物体应对外源物质诱导形成氧化应激的主要解毒及抗氧化防御酶系,可通过催化还原型谷胱甘肽与有毒的疏水亲电物质发生轭合反应,在外源物质对机体产生毒性之前将其排出体外。为了监测和评价化学污染物的毒性效应,检测导致机体的氧化应激生物标记物有SOD、CAT、GPx等抗氧化酶类以及氧化损伤的生化指标H2O2和丙二醛(MDA)等。RNA-seq可以对某一生理条件下,一个或多个细胞内所有转录产物或所有mRNA的集合进行转录组研究,全面快速地获得在特定状态下、特定组织或器官几乎所有的转录本序列信息,从整体水平分析基因的转录及其调控规律。通过分析基因结构以及功能,揭示特定生物学过程或疾病发生过程中的分子机理,可作为鉴别环境污染物胁迫下机体差异基因表达变化的可靠手段。肝脏是动物代谢、解毒和参与免疫机能的重要器官。前期的研究表明,敌百虫水域污染会影响氧化代谢等生理过程,从而使得机体内的代谢发生改变,并最终导致组织损伤及病变。本研究以不同发育时期的中国林蛙为研究对象,分别检测3个低剂量浓度敌百虫(0.01,0.1及1.0 mg/L)暴露2周、4周后对机体生长、发育及代谢产生的毒理学效应。从发育毒理学的角度研究低剂量敌百虫暴露对中国林蛙蝌蚪生长发育的影响。在遗传毒性效应方面,通过检测低剂量敌百虫暴露对中国林蛙蝌蚪红细胞微核及核异常的变化以及分析对白细胞数量的影响,研究敌百虫的遗传毒性和对机体免疫的影响。在基因损伤水平,通过彗星电泳检测低剂量敌百虫诱发蝌蚪肝细胞产生的基因损伤;在细胞水平,用DNA ladder的形成检测低剂量敌百虫水域污染诱发蝌蚪肝细胞的凋亡。在此研究基础上,以中国林蛙成体肝组织为材料,通过分析低剂量敌百虫暴露诱发林蛙肝组织的氧化应激效应,研究敌百虫对于机体新陈代谢的影响。主要检测与氧化代谢密切相关的SOD、CAT和GST活性,并对MDA含量进行测定。在组织和细胞病理学方面,分别用光镜和透射电镜观察分析低剂量敌百虫导致的肝组织、细胞和细胞器的损伤。在分子水平上,基于RNA-seq技术,构建0.1 mg/L敌百虫暴露和空白对照组中国林蛙肝的基因表达文库,对敌百虫胁迫下林蛙肝细胞的转录组进行全面解析,对暴露前后差异基因进行筛选,同时结合实时定量PCR技术对低剂量敌百虫胁迫下林蛙肝代谢的分子机制进行了探讨。具体研究结果如下:1.低剂量敌百虫对中国林蛙幼体生长发育的毒性效应。低剂量敌百虫对林蛙蝌蚪暴露的结果显示,与对照组相较,敌百虫暴露组蝌蚪的存活率明显降低。同时,敌百虫暴露对蝌蚪的体长、体重具有显著的抑制作用,对于发育时期具有明显的滞后效应。而且随敌百虫浓度的升高及暴露时间的延长呈现明显的累积效应。观察显示,低剂量敌百虫暴露对蝌蚪发育的各个时期均可产生致畸效应,畸形主要表现为尾部强直性弯曲、骨骼畸形、身体轴线弯曲及前肢缺失。这些结果可以推断,中国林蛙蝌蚪可能对水域环境中敌百虫较为敏感,低剂量敌百虫暴露即可导致蝌蚪生长发育的抑制、个体畸形增加及变态的延迟,进而可能导致林蛙蝌蚪种群数量的下降。2.低剂量敌百虫对中国林蛙幼体的遗传毒性效应。通过敌百虫暴露的蝌蚪微核检测结果显示,不同低剂量敌百虫均可引起蝌蚪红细胞产生微核和核异常发生,其效应随暴露时间的延长呈累积效应。在1.0 mg/L敌百虫暴露可导致红细胞核畸形,包括核内凹、核形不规则、微核、双核及核边移等。此外,与对照组相比,敌百虫暴露后蝌蚪的白细胞比率均有升高,其中0.1 mg/L和1.0 mg/L处理组白细胞比率是对照组的2倍。这些检测结果表明,低剂量敌百虫暴露对蝌蚪红细胞具有遗传毒性效应,可用于评价敌百虫对非靶标水生动物的毒性指标。同时,敌百虫暴露过程中蝌蚪血液中白细胞比例升高,说明机体在抵御环境中敌百虫的侵害过程中,可能通过增加外周血液中白细胞以提高免疫能力。3.低剂量敌百虫对中国林蛙幼体肝组织的基因损伤和细胞凋亡效应。通过彗星电泳技术检测彗尾DNA含量,对低剂量敌百虫暴露导致林蛙蝌蚪肝细胞的基因损伤效应进行评价。结果显示,与对照组相较,敌百虫处理组彗尾荧光密度减弱,成扫帚状拖尾。低剂量敌百虫所引起的肝细胞基因损伤主要为1级损伤(损伤度为5-20%),较为微弱;仅1.0 mg/L处理组出现少量2级损伤(损伤度为21-40%)。敌百虫暴露对蝌蚪产生的基因损伤具有明显的剂量依赖和时间累积效应。利用DNA ladder检测低剂量敌百虫对蝌蚪肝细胞凋亡的结果表明,与对照组相比,敌百虫处理组蝌蚪肝细胞产生微弱的DNA片段化条带,即细胞凋亡效应。这一结果与彗星电泳的结果一致。同样显示敌百虫剂量依赖和时间累积效应。4.低剂量敌百虫暴露对中国林蛙肝脏的氧化应激效应。检测不同暴露时间的林蛙肝脏中SOD、CAT及GST的活性和MDA含量的结果显示,与对照组相比,不同剂量敌百虫暴露后,林蛙肝脏中SOD活性和CAT活性均显著增高;而GST活性除在0.1 mg/L敌百虫暴露4周显著性增加,其他各处理组与对照组的差异不显著。测定肝组织中脂质过氧化物代表因子MDA含量显示,敌百虫暴露后各处理组MDA含量有所下降。其中0.1 mg/L组暴露2周,MDA活性显著下降,而其他各组无显著性差异;暴露4周,0.01 mg/L组MDA活性也降低,且差异性显著。上述可见,低剂量敌百虫暴露对肝组织SOD和CAT酶活性为激活效应,表明敌百虫暴露可通过激活林蛙体内这两种酶活性以清除体内产生的多余自由基。而GST活性未发生明显变化,推测GST在暴露初期可能未参与体内的敌百虫代谢或对敌百虫胁迫不敏感,而GST活性后来升高则表明机体开始通过自身防御体系应对外源毒性物质的效应。而机体内过氧化物被氧化酶及时清除可有效缓解氧化应激强度,进而导致MDA活性未发生大幅度的变化。5.低剂量敌百虫暴露后林蛙肝组织的病理学观察。组织学观察显示,敌百虫暴露4周,与对照组相比,处理组部分林蛙肝组织结构发生改变,出现核偏移、空泡化、细胞间隙增大、肝细胞坏死及核固缩等现象。同时随着敌百虫浓度的增高,肝组织中黑色素明显增多。肝组织超微结构显示,敌百虫暴露4周后,与对照组相比,敌百虫暴露组肝脏细胞器受损,细胞核畸形,细胞质中糖原减少,出现线粒体肿胀、糙面内质网膨胀、细胞核固缩、空泡化等细胞凋亡特征。因此,敌百虫暴露可通过氧化应激相关的代谢紊乱导致肝脏的组织和细胞的损伤。6.敌百虫暴露下中国林蛙肝组织转录组学分析。利用RNA-seq技术构建了敌百虫暴露前、后中国林蛙肝组织的转录组文库,原始数据经过滤、组装,共获得55,235条独立基因,平均长度为756 bp。以NCBI、基因本体论数据库(GO)、直系同源基因簇(COG)及京都基因与基因组百科全书(KEGG)等数据库做参考,利用BLAST和BLAST2GO对所得独立基因进行注释,共有27,781条独立基因获得了明确的功能注释,占总数的50.3%。COG对7,375个独立基因功能进行分类注释可将其分为24个类群。GO功能对15,631个独立基因进行注释,可分为53个亚类,其中共有52.18%的独立基因为生物过程功能组,34.83%为细胞组成功能组,12.99%为分子功能功能组。进而通过KEEG数据库共注释了 16,923个独立基因,共参与257个信号通路,包括代谢途径、内吞作用、MAPK信号通路及PPAR信号通路等。7.敌百虫暴露前、后差异基因筛选。通过对获得的0.1 mg/L敌百虫暴露前、后的肝组织转录组文库中差异表达基因筛选,共筛选得到3,329个差异表达独立基因,涉及52个亚类。其中,共有1444个基因表达上调,1885个基因表达下调。对差异基因进行综合分析显示,敌百虫暴露可影响中国林蛙对外源物质的降解和代谢、对刺激的应激及生物过程的调节。表明敌百虫显著影响了林蛙肝脏的代谢及其对外源物质的降解及解毒途径,造成肝细胞中不同细胞器结构的改变,影响其正常生物学功能,此时机体启动了抗氧化防御系统,通过调节相关酶活性发生变化来应对敌百虫暴露引起的氧化应激。8.代谢相关差异表达基因的鉴定与分析。对差异表达基因中涉及代谢通路及外源物质降解的4个差异基因进行qPCR验证,两个上调基因为eNOS和CYP2C,两个下调基因为CYP3A和GST。检测结果显示,4个基因的表达趋势与RNA-seq检测结果一致。其中,一氧化氮合酶(eNOS)基因表达量的显著上调,与机体肝组织应对敌百虫胁迫的应激反应有关;细胞色素氧化酶CYP2C基因表达的上调与机体对敌百虫的代谢的增强密切相关。同时,血管扩张依赖于内皮细胞CYP2C表氧化酶的激活,因此敌百虫暴露后,林蛙肝组织eNOS和CYP2C的表达同时上调。外源毒性物质对CYP3A具有调节作用,毒性物质敌百虫在机体内的蓄积可抑制CYP3A1基因表达;此外,外源物质可通过转录或体内的不完全降解来影响GST基因的表达,GST基因表达的下调再次说明它在林蛙体内敌百虫的解毒等生理学过程具有重要作用。综上可见,eNOS、CYP2C、CYP3A和GST基因参与了敌百虫暴露后的氧化应激代谢反应。这些数据为后续研究敌百虫对肝组织毒性效应的分子机制提供了基础。综上所述,本研究通过低剂量敌百虫对中国林蛙幼体和成体的水体暴露,从对幼体生长发育、肝组织的细胞和亚细胞结构、代谢相关酶的活性以及基因差异表达变化等多层次检测敌百虫对于非靶标动物产生的毒理效应。分析表明,低剂量敌百虫对中国林蛙的生长发育及种群数量具有抑制、干扰作用,对机体具有遗传毒性,可形成基因损伤及细胞凋亡,其效应呈现时间与剂量的依赖性。同时,低剂量敌百虫暴露可引起的肝组织损伤,诱发林蛙肝脏产生氧化应激效应。另外,为探明有机磷类杀虫剂对非靶标生物机体正常机能产生干扰效应相关基因的表达及分子通路的研究,对敌百虫胁迫下林蛙的肝组织转录组进行全面解析,并应用qPCR技术对低剂量敌百虫胁迫下林蛙的肝代谢分子机制进行分析。这些数据对深入探讨两栖类种群数量的下降的生态毒理原因具有一定的理论意义。同时,为两栖动物生殖环境的保护、水产养殖、资源保护、食品安全、水源涵养地水域污染的治理提供科学依据。