日本乙型脑炎病毒是一种重要的人畜共患传染病病原。该病毒不仅侵害人的神经系统,导致成年人和儿童的死亡,而且也可引起猪的繁殖障碍疾病,每年给养猪业造成巨大的经济损失。该病毒主要流行在南亚、东南亚和东亚一带,近年来,有不断扩展的趋势,在澳大利亚和俄罗斯都有一些病例的报道,我国也是日本乙型脑炎的多发区。当前对于乙型脑炎的防制主要依靠疫苗接种,缺乏特效治疗药物。N-糖基化在蛋白质的加工和转运过程中发挥着重要的作用,近年来越来越多的研究表明N-糖基化对病毒的毒力、复制、感染和免疫等都具有重要的生物学功能。prM和E是日本乙型脑炎的两个重要的结构蛋白,二者形成prM-E异二聚体,并能组装成病毒样颗粒,在受体结合、膜融合、神经毒力、神经侵袭力等发挥着主要的作用,同时可诱导机体产生中和抗体。日本乙型脑炎病毒的prM和E蛋白分别在其第15位和154位氨基酸残基处含有一个N-糖基化位点,prM蛋白中的N-糖基化位点在黄病毒属内是高度保守的,而E蛋白的N-糖基化位点则具有一定的变异。当前,对于日本乙型脑炎病毒N-糖基化的研究还没有深入开展。本论文研究了日本乙型脑炎病毒prM和E蛋白上N-糖基化位点分别对E蛋白折叠、分泌、病毒样颗粒的形成和对细胞致病力的影响。主要获得以下结果：1.prME糖基化突变表达质粒的构建扩增日本乙型脑炎病毒prME基因,将基因连接到真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建质粒pcprME。利用PCR介导的定点突变,分别将prM和E蛋白中的天冬酰胺突变为谷氨酸,消除基因的N-糖基化位点。将突变的prME基因连接到真核表达载体pcDNA3.1(+),构建质粒mcprME15、mcprME154和mcprME15154,测序结果表明所有的点突变成功。将构建的质粒分别转染HEK-293FT细胞,经间接免疫荧光试验证实了prM和E蛋白的高效表达。将表达的蛋白进行Western Blot分析,结果显示N-糖基化位点缺失的prM和E蛋白在SDS-PAGE上的迁移率要大于野生型蛋白,说明点突变的prM和E蛋白N-糖基化位点被成功消除。2.N-糖基化对E蛋白折叠的影响将真核表达质粒pcprME、mcprME15、mcprME154和mcprME15154分别转染HEK-293FT细胞,用E蛋白的空间抗体作为一抗,进行间接免疫荧光的试验,结果显示当prM蛋白的N-糖基化位点缺失时,质粒mcprME15和mcprME15154转染细胞,所有表达的E蛋白都不能获得正确的空间构象,说明prM蛋白的N-糖基化对E蛋白的正确折叠有决定性的作用。当E蛋白的N-糖基化位点缺失时,质粒mcprME154表达的绝大部分的E蛋白没有被正确折叠,仅有少量的E蛋白获得了正确的空间构象。说明E蛋白的N-糖基化对于其折叠具有重要作用,虽然在缺失的蛋白中也可以发生正确折叠,但其折叠效率却大大降低。3.N-糖基化对E蛋白分泌的影响将质粒pcprME、mcprME15、mcprME154和mcprME15154转染HEK-293FT细胞,收集细胞的上清。用双抗体夹心ELISA方法检测上清中E蛋白的含量,结果表明质粒pcprME上清中E蛋白的含量要远高于mcprME 15、mcprME 154和mcprME15154上清中E蛋白的含量。证明了当prM或E蛋白N-糖基化位点缺失时,E蛋白的分泌都会受到极大的影响。4.N-糖基化对prM和E蛋白形成的病毒样颗粒的影响将质粒pcprME、mcprME15、mcprME 154和mcprME15154分别转染HEK-293FT细胞,用2.5%戊二醛固定液固定细胞。在电子显微镜下观察细胞切片,最后在质粒pcprME和mcprME 154转染的细胞内发现了病毒样颗粒,而在mcprME、mcprME15154转染的细胞中即使增加细胞切片的数目也没有观察到病毒样颗粒。证明了prM蛋白中的N-糖基化对于病毒样颗粒的形成具有决定性的影响,而E蛋白中的N-糖基化位点对于病毒样颗粒的形成不具有决定性作用,但对其产生的效率具有一定的影响。5.prM和E蛋白的N-糖基化对细胞病变效应的影响质粒pcprME、mcprME15、mcprME 154和mcprME15154分别转染HEK-293FT细胞,胰酶消化后,收集细胞,使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测细胞的凋亡比率。结果显示质粒pcprME (9.38%)转染细胞所造成的细胞凋亡率要高于mcprME15 (2.00%)、mcprME154 (3.74%)和mcprME15154(1.30%)。说明了N-糖基化影响了prM和E蛋白对细胞的毒性。