增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)起初在患有系统性红斑狼疮患者的血清中发现,之后在其他物种(如哺乳动物,果蝇等)中也发现了它的存在。由于PCNA蛋白结构在进化上的保守性,使得病毒和原核细胞中也具有类似PCNA的DNA聚合酶辅助因子。在不同进化水平的生物中,它们具有相同的二级结构单位—?螺旋和?折叠,和相似的三级结构(一个可以在DNA链上滑动的环形滑动夹)。哺乳动物的PCNA以同源三聚体的形式存在于细胞核,是DNA合成不可或缺的因子,它的表达水平与细胞周期的变化同步。在杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa california multiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)中鉴定有与编码增殖细胞核抗原蛋白序列同源的基因pcna,又称AcOrf-49,全长771 bp,但是在DNA复制中的作用还不明确。在杆状病毒的长期进化过程中,其基因组中的某些基因会发生高频率的缺失和获得。其中,AcMNPV的pcna基因(Ac-pcna)就是由其宿主Sf9(Spodoptera frugiperda 9)的pcna基因(Sf-pcna)演变获得而来。为了进一步明确Ac-pcna和Sf-pcna在AcMNPV侵染宿主细胞Sf9以及感染甜菜夜蛾过程中的作用机制,我们开展了Ac/Sf-PCNA的功能研究,并在此基础上,探讨了Ac/Sf-PCNA对外源基因表达的影响。本研究分为三部分内容:第一部分:过表达Ac/Sf-PCNA的重组杆状病毒的构建以及Ac/Sf-PCNA在宿主细胞的表达分析。我们首先利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒重组表达系统构建了过表达Ac/Sf-PCNA的重组病毒:AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP。分别用5 MOI(multiplicity of infection)的重组病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP侵染Sf9细胞,荧光显微镜观察发现,细胞的荧光强度随感染时间的延长不断增加,并且可以产生荧光的细胞数目也在不断增加。Western blot结果也表明,随着感染时间的延长Ac/Sf-PCNA-EGFP的表达量逐渐增加,在感染72 h后达到峰值。而Ac-PCNA-EGFP在核内的聚集比Sf-PCNA-EGFP早12 h,在12 h即可检测到。第二部分:增殖细胞核抗原Ac/Sf-PCNA的功能分析。采用GenBank和PDB数据库检索Ac/Sf-PCNA的功能域,采用DNAMAN软件将二者的氨基酸序列进行差异比对。比对分析显示Ac-PCNA与Sf-PCNA具有43.73%的氨基酸序列同源性,但是这两个蛋白的C端和N端是高度保守的。首先,用5 MOI的野生病毒AcMNPV和重组病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP侵染Sf9细胞1-3天,绝对定量qPCR检测Ac/Sf-PCNA对病毒以及宿主细胞Sf9基因组DNA复制的影响。结果显示AcMNPV介导的Ac-PCNA和Sf-PCNA的过表达可以刺激AcMNPV基因组在宿主细胞Sf9中的复制。同时,AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP对Sf9基因组在感染过程中的复制也具有显著的刺激作用。之后,蚀斑实验检测,分别用5 MOI的野生病毒AcMNPV-EGFP和重组病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染12-96 h的Sf9细胞的上清液中的子代病毒粒子数量。结果表明,AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP可提高子代病毒产量,且AcMNPV-Sf-pcna-EGFP对子代病毒增殖的促进作用强于AcMNPV-Ac-pcna-EGFP。在AcMNPV-Ac-pcna-EGFP和AcMNPV-Sf-pcna-EGFP感染72 h的细胞中,生成芽生型病毒粒子(budded virus,BV)的量分别是AcMNPV-EGFP感染细胞的14.53和19.83倍。随后以AcMNPV-Ac-pcna-EGFP为代表,用5 MOI的AcMNPV-EGFP和AcMNPV-Ac-pcna-EGFP分别侵染Sf9细胞12-48 h,RT-PCR结果显示在病毒感染的前24 h,AcMNPV-Ac-pcna-EGFP处理组中ie2基因的转录水平显著升高,在病毒感染24 h后,AcMNPV-Ac-pcna-EGFP处理组中ie2基因的转录水平缓慢下降。而在病毒感染的12 h,AcMNPV-Ac-pcna-EGFP处理组中38K、vp39基因的转录水平达到最大值。这就表明Ac-PCNA能显著提高极早期基因ie2的转录水平,并能进一步提高晚期基因如38K和vp39的转录水平。最后,虫试实验中分别用20μL,1×10~7pfu/mL的AcMNPV-EGFP和AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP连续饲喂二龄期甜菜夜蛾幼虫五天。幼虫的重量、致死率、化蛹率及羽化率结果表明,饲喂AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP的幼虫生长迟缓,并且死亡率远高于饲喂AcMNPV-EGFP的幼虫,而化蛹率及羽化率都明显低于野生病毒处理组。在AcMNPV-Ac-pcna-EGFP和AcMNPV-Sf-pcna-EGFP处理组中,幼虫的平均致死率分别是83.33%和91.67%,是AcMNPV-EGFP处理组的1.43和1.57倍;化蛹率分别是16.67%和8.33%,是AcMNPV-EGFP处理组的0.40和0.20倍;羽化率分别是6.67%和3.33%,是AcMNPV-EGFP处理组的0.33和0.17倍。这些结果表明,过表达Ac/Sf-PCNA的重组病毒具有更强的杀虫效应,即具有较高的抗虫活性,且重组病毒AcMNPV-Sf-pcna-EGFP比AcMNPV-Ac-pcna-EGFP具有更高的抗虫活性。第三部分:AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP对宿主细胞SfP53蛋白的表达、葡萄糖代谢及外源蛋白表达的影响。前两部分实验已经对两个重要的DNA聚合酶推进因子—Ac/Sf-PCNA在分子、细胞和虫体水平的功能作了初步分析,杆状病毒侵染昆虫会调节宿主的凋亡途径以及代谢通路,以利于自身的复制。本章中,我们着重分析了重组杆状病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP如何影响凋亡蛋白SfP53的表达以及葡萄糖代谢并进一步影响外源蛋白Renilla Luciferase的表达。首先,分别用5 MOI的AcMNPV-EGFP和AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP侵染Sf9细胞12-72 h,Western blot检测分析宿主凋亡蛋白SfP53的表达。与野生病毒相比,重组病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP整体上延迟了宿主细胞SfP53的表达。在明确了宿主细胞SfP53的表达规律后,同样分别用5 MOI的AcMNPV-EGFP和AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP侵染Sf9细胞,Western blot检测SfP53在核内的聚集情况,表明SfP53在核内的聚集情况与SfP53总蛋白的变化趋势相近。然后,用0.25 MOI的AcMNPV-EGFP和AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP分别与0.25 MOI的AcMNPV-renilla luciferase-RFP共侵染Sf9细胞1-72 h,检测宿主细胞内葡萄糖的含量。在感染后4 h,AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP处理组中细胞内葡萄糖浓度明显高于AcMNPV-EGFP处理组,分别是AcMNPV-EGFP处理组的1.28和1.39倍。在随后的时间段内,葡萄糖浓度呈先下降后上升的趋势。进一步分析,我们又发现AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP处理组葡萄糖浓度回升的时间点比AcMNPV-EGFP处理组提早24-36 h,并且AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP处理组的最低葡萄糖浓度的数值要高于AcMNPV-EGFP处理组,分别是AcMNPV-EGFP处理组的1.20和1.37倍。最后用不同感染复数的AcMNPV-EGFP、AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP分别与0.25 MOI的AcMNPV-renilla luciferase-RFP共侵染Sf9细胞72 h,检测外源蛋白Renilla Luciferase的表达情况,结果显示AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP处理组中Renilla Luciferase的表达随感染复数的增加缓慢减弱,而AcMNPV-EGFP处理组中Renilla Luciferase的表达显著减弱,表明AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP可以弱化由病毒感染导致的外源蛋白的下调表达。用0.25 MOI的AcMNPV-EGFP、AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP分别与0.25 MOI的AcMNPV-renilla luciferase-RFP共侵染Sf9细胞12-72 h,检测外源蛋白Renilla Luciferase的表达情况,结果显示AcMNPV-Ac-pcna-EGFP处理组和AcMNPV-Sf-pcna-EGFP处理组中Renilla Luciferase的表达分别在侵染后的48和24 h检测到,分别比AcMNPV-EGFP处理组提早了12和36 h,表明AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP可以辅助外源蛋白提早表达。所以,AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP通过延缓宿主细胞凋亡蛋白SfP53的表达进程进而延缓细胞的凋亡为病毒的复制争取更多时间,同时刺激宿主细胞对葡萄糖的利用为病毒自身的复制提供能量,进而有利于外源基因的表达。本研究分别在DNA、细胞和虫体水平上分析了AcMNPV侵染宿主过程中与病毒和宿主DNA复制有关的Ac/Sf-PCNA蛋白的功能,明确了它们对促进病毒和宿主DNA复制功能的重要性,获得了两株高抗虫效率的病毒杀虫剂AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP,并进一步完善了重组病毒通过延迟凋亡蛋白SfP53的表达以及刺激对葡萄糖的利用,进而利于外源基因表达的机制。本研究证实了Ac/Sf-PCNA的功能,为Ac/Sf-PCNA的应用提供了实验依据,为利用AcMNPV科学防治鳞翅目害虫奠定了理论基础。