论文部分内容阅读
随着抗生素的滥用现象日益严重,细菌的耐药性问题日益加剧,新抗生素的研发速度远远赶不上耐药菌的产生速度,寻找新的抗菌制剂刻不容缓。而噬菌体及其裂解酶因其高效的杀菌能力及高度的宿主专一性而成为新一代抗菌制剂的候选之一,对于噬菌体及其裂解酶的研究在近些年被许多研究者提上日程。粪肠球菌是普遍存在于人或动物肠道、口腔及生殖道内的条件致病菌,可引起人的心内膜炎、菌血症、泌尿道感染及脑膜炎等疾病。在需氧革兰氏阳性菌导致的院内感染中,其致病率仅次于葡萄球菌,而多重耐药粪肠球菌所引起的疾病已经对人类健康造成极大威胁。本研究就目前粪肠球菌的严重耐药性现状,利用临床分离的多重耐药菌,从医院污水中分离到一株可广泛裂解耐药粪肠球菌的噬菌体IME-EF1,分析研究其生物学特性并进行全基因组测序;克隆表达噬菌体裂解酶,验证其裂解活性及测定裂解谱;构建小鼠腹部粪肠球菌感染模型对噬菌体IME-EF1及其裂解酶的治疗效果进行评估。方法:以临床分离的多重耐药粪肠球菌EF002为指示菌,采用噬菌斑实验从医院污水中分离噬菌体;利用双层平板培养法测定噬菌体IME-EF1效价,同时测定噬菌体的最佳感染复数及一步生长曲线;负染法透射电镜观察噬菌体形态;蛋白酶K/SDS法提取噬菌体基因组并酶切后电泳分析;ION TORRENT高通量测序仪测定噬菌体IME-EF1全基因组序列。PCR扩增噬菌体IME-EF1裂解酶基因,克隆到pColdI表达载体进行诱导表达;采用点滴法与浊度法验证蛋白裂解活性及测定裂解谱;ELISA和Western blotting分析验证裂解酶蛋白表达与否及与敏感菌是否特异性结合。给小鼠腹部注射最小致死量的粪肠球菌EF002,感染一段时间后,分组腹部注射噬菌体IME-EF1或其裂解酶进行治疗,记录小鼠死亡率及血液内细菌量,判断噬菌体及其裂解酶的治疗效果。结果:成功分离出一株噬菌体IME-EF1,该噬菌体能够裂解多株临床分离的粪肠球菌;电镜观察呈蝌蚪形,最佳感染复数为1;通过绘制一步生长曲线证明该噬菌体感染后的潜伏期为25min,爆发期35min,裂解量60pfu。成功表达噬菌体裂解酶蛋白Lysin-EF2。该蛋白能够裂解实验室现有的所有粪肠球菌,包括2株耐万古霉素粪肠球菌;可与敏感菌特异性紧密结合。动物实验表明噬菌体IME-EF1及其裂解酶Lysin-EF2对于粪肠球菌所导致的感染具有较好的治疗效果,裂解酶治疗效果优于噬菌体;而在感染后及时有效的给药对于降低小鼠死亡率有一定意义。结论:随着粪肠球菌耐药性日趋严重,积极探索不依赖抗生素的治疗方法势在必行。研究结果表明利用临床分离的耐药粪肠球菌分离裂解性噬菌体,表达重组噬菌体裂解酶,并用于治疗细菌感染性疾病的方法是可行的,上述研究为耐药粪肠球菌的抗生素替代疗法打下了基础。