论文部分内容阅读
肽酰-脯氨酰顺反异构酶胞内活性分析的研究摘要肽酰-脯氨酰顺反异构酶(peptidyl prolyl cis-trans isomerase,PPI)是多家族类蛋白质,基本功能是与蛋白质的脯氨酸残基结合,催化Xaa-Pro之间肽键的顺反异构反应.本研究旨在初步尝试建立PPI胞内活性检测的方法.基于RNase T1作为体外底物分析PPI活性已取得的研究成果,在探讨胞内PPI活性的研究中,利用分子生物学方法开展了一些研究,我们尝试在细胞内表达RNase T1作为PPI的作用底物.来自太平洋的水母(Aequorea vitoria)中的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein GFP)是近年来广泛应用的基因标签,但这种野生型的GFP比标准的报告蛋白(如:β-半乳糖苷酶)的检测灵敏度还低.其突变体EGFP(enhanced green fluorescent protein EGFP)具有野生型GFP 35倍的荧光强度,可用来指示上游蛋白正确折叠,在该研究中作为指示RNase T1正确折叠的"折叠标签".即用EGFP的绿色荧光标记RNase T1的正确折叠(有酶活),而RNase T1的活性来指示PPI的胞内活性,在这种设计思想下RNase T1是本课题的直接研究对象,而研究目的是间接探讨PPI的胞内酶活,希望为PPI的胞内活性分析奠定基础.我们分别在原核大肠杆菌表达系统(胞内表达)和真核毕赤酵母表达系统(分泌表达)做了表达研究探索.构建好的融合基因经酶切后与pUC18载体连接,连接产物转化大肠杆菌DH5α.在大肠杆菌中诱导表达RNase T1、EGFP和RNase T1与EGFP的融合蛋白,结果表明EGFP在大肠杆菌中获得可溶性表达,但没有分离得到RNaseT1,可能由于RNaseT1被胞内敏感蛋白酶降解,而去除了它的细胞毒作用,这与胞内表达RNase T1没有获得成功的报道相一致.SDS-PAGE电泳分析表明,表达的融合蛋白RNase T1-EGFP仅比单独表达的EGFP分子量稍大,分离纯化后没有RNase T1活性,说明上游的RNase T1同样被降解.由于RNase T1的胞内毒性,我们尝试酵母表达系统,选取分泌表达的穿梭质粒pPIC9K为表达载体,体外构建融合基因RNase T1-EGFP与pPIC9K的重组表达载体,电转化毕赤酵母菌(Pichiapastoris GS115),筛选重组转化子进行诱导表达的工作正在进行中.