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隐孢子虫病是由隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)感染引起的一种人兽共患原虫病,严重威胁人和多种畜禽的健康和生命。目前,已在100多个国家的包括哺乳动物、鸟类、爬行类和鱼类等240多种动物和人体内发现了隐孢子虫,造成了较为严重的经济影响和社会效应。隐孢子虫感染可导致免疫缺陷畜禽和人、幼龄宿主和移植个体持续性水样或致命性腹泻,健康动物或成年动物虽为无或轻微感染,表现一过性、自限性腹泻,但可成为潜在的传染源。鉴于隐孢子虫的宿主广泛性和严重危害,国内外学者在病原生物学、致病特征、疫苗和药物方面做了大量工作,然而,还没有开发出有效的预防性措施和药物防控隐孢子虫病。前人研究发现,宿主抵御隐孢子虫感染主要依靠细胞免疫,尤其是CD4~+T细胞,同时研究发现补体裂解片段C5a通过与其受体C5a R结合调节CD4~+T细胞的分化和效应,参与抗感染免疫反应。但是,C5a/C5a R信号在隐孢子虫感染中的作用尚不清楚。基于此,本研究以人兽共患微小隐孢子虫(C.parvum)为研究对象,以C.parvum感染BALB/c乳鼠为模型,研究了C5a/C5a R信号在C.parvum感染中对宿主CD4~+T细胞亚群主效应细胞因子和转录因子的调节作用,获得了以下结果:1. 建立了C.parvum感染BALB/c乳鼠模型:将1×10~7个C.parvum卵囊脱囊后经口感染5 d的BALB/c乳鼠,在感染后(post infection,pi)6 h、12 h、24 h、36 h、48h、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d、15 d、20 d、25 d和30 d采集回肠组织,利用基于隐孢子虫HSP70基因的Real-time PCR进行感染情况检测,利用HE染色进行组织病理学观察,利用抗酸染色法检测大肠内容物中的卵囊。研究发现,在6 hpi即可检测到HSP70基因的表达,直至25 dpi,高峰在7 dpi;在5 dpi和7 dpi,可见感染乳鼠回肠绒毛寄生有隐孢子虫,回肠绒毛脱落、萎缩,回肠末端黏膜结构完整性破坏、细胞间隙明显变宽,有中性粒细胞及炎性细胞浸润;在7 dpi的乳鼠大肠内容物中可发现大量玫瑰红色或暗红色C.parvum卵囊。2. C.parvum感染引起BALB/c乳鼠回肠组织C5a和C5a R的m RNA显著上调表达:在C.parvum感染后采集乳鼠回肠组织,利用Real-time PCR测定了回肠组织的C5a和C5a R m RNA的表达水平,发现C5a在3 dpi、4 dpi、20 dpi和30 dpi显著升高;C5a R在12 hpi、36 hpi、4 dpi、5 dpi、7 dpi、15 dpi和30 dpi显著高于对照组,并在5 dpi达到高峰。3. C.parvum感染诱发了BALB/c乳鼠回肠组织中Th1型免疫效应:利用Real-time PCR测定和分析感染乳鼠回肠组织中CD4~+T细胞亚群Th1、Th2、Th17和Treg主效应细胞因子及其相应的转录因子的相对表达情况发现,Th1细胞主效应因子IFN-γ在2dpi、4 dpi、5 dpi、6 dpi、7 dpi、9 dpi、10 dpi、20 dpi、25 dpi和30 dpi显著上调表达,在6 dpi达到高峰,其转录因子T-bet也在3 dpi、7 dpi、10 dpi、20 dpi和30 dpi显著上调表达;Th2细胞主效应因子IL-4及其转录因子GATA-3的m RNA相对表达水平均呈现动态变化,但在多数时间点显著下调表达;Th17细胞主效应因子IL-17仅在3 dpi显著上调表达,而在5 dpi、6 dpi和8 dpi显著下调表达,其转录因子RORγt的表达水平也在多数时间点显著下调;Treg细胞亚群主效应因子TGF-β也在多数时间点显著下调表达,仅在20 dpi上调表达,其转录因子Foxp3在3 dpi和4 dpi也显著下调表达。4. C5a/C5a R信号可通过调节CD4~+T细胞免疫效应参与C.parvum与乳鼠回肠组织的互作:本研究在C.parvum感染乳鼠前6 h,依据乳鼠体重经口灌喂3 mg/kg C5a R抑制剂(即PMX 205),乳鼠感染C.parvum卵囊后,每隔3 d依体重灌喂PMX 205,利用Real-time PCR对不同时间点的回肠组织检测分析发现,与单纯感染组相比,抑制剂组感染乳鼠回肠组织中的Th1细胞主效应因子IFN-γ在多数时间(2 dpi、4 dpi、6dpi、7 dpi、9 dpi和10 dpi)显著下调,其转录因子T-bet在感染后7 d、9 d、10 d和30d显著下调表达;抑制剂组感染乳鼠回肠组织中的Th2细胞主效应因子IL-4在多数时间显著下调表达,其转录因子GATA-3在感染后5 d和7 d显著下调表达;抑制剂组感染乳鼠回肠组织中的Th17细胞主效应因子IL-17在多数时间(2 dpi、3 dpi、4 dpi、5dpi、8 dpi和9 dpi)显著上调表达,但其转录因子RORγt在感染后多数时间表达显著下调,仅在25 d显著上调表达;抑制剂组感染乳鼠回肠组织中的Treg细胞主效应因子TGF-β在4 dpi、6 dpi、7 dpi和25 dpi显著下调表达,其转录因子Foxp3在7 dpi和10dpi显著下调表达,仅在3 dpi显著上调表达;采集单纯感染组和抑制剂组6 dpi的回肠组织进行组织病理学观察发现,C5a/C5a R信号显著改善C.parvum感染引起的乳鼠回肠组织绒毛直径和黏膜厚度变化,但不影响绒毛长度与隐窝深度比值;隐孢子虫HSP70基因的m RNA检测发现,C5a/C5a R信号能显著影响C.parvum在回肠组织细胞中的增殖。综上所述,C.parvum感染活化了BALB/c乳鼠回肠组织C5a/C5a R信号,且该信号通过影响乳鼠回肠组织中CD4~+T细胞Th1、Th2、Th17和Treg亚群主效应细胞因子及其转录因子的表达参与C.parvum与乳鼠回肠组织的互作。这些研究结果为深入探讨宿主防御隐孢子虫感染的免疫机理,筛选用于有效防控隐孢子虫病的新思路提供了理论依据。