目的:1990年,Kitagawa等研究证实脑缺血预处理能够通过诱导脑缺血耐受减轻脑缺血/再灌注损伤。随后有学者提出远端器官缺血预处理的实验方案,为缺血预处理对抗缺血/再灌注损伤提供了新思路。近年来,我室研究证实肢体缺血预处理(limb ischemic preconditioning,LIP)可减轻大鼠海马CA1区神经元的缺血/再灌注损伤。虽然脑缺血预处理和LIP都可以减轻脑缺血/再灌注损伤,但是从临床应用方面考虑,LIP具有更好的安全性和可操作性,也更容易为病人所接受。然而,此种LIP诱导脑保护作用的机制尚不完全清楚。上世纪50年代,比利时科学家de Duve通过透射电子显微镜首次观察到自噬的结构,并在1963年溶酶体国际会议上提出了“自噬”的说法。研究人员发现,脑缺血/再灌注损伤过程中,存在着自噬激活的现象。随后大量的实验研究发现,适度的激活自噬可以产生脑保护作用。2010年,Sheng等证实大鼠局灶性脑缺血和脑缺血预处理均可诱导自噬,但是脑缺血预处理诱导的自噬较损伤性缺血持续时间长、强度较大,能有效地减轻脑缺血损伤;给予自噬抑制剂巴弗洛霉素A1或三甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)能够通过减弱LC3-II、Beclin1和HSP 70的上调以及p 62的下调,抑制脑缺血预处理的保护作用;相反,给予自噬激活剂雷帕霉素能够模拟脑缺血预处理上调LC3-II和Beclin1的表达,激活自噬,减轻缺血性损伤。2011年,Yan等在大鼠局灶性脑缺血模型中发现,高压氧预处理能激活自噬减轻缺血性脑损伤,发挥脑保护作用;而于预处理前应用自噬抑制剂3-MA可减弱上述脑保护作用。之后,Jiang等证实二甲双胍通过激活自噬减轻局灶性脑缺血性损伤,分别应用AMPK抑制剂复合物C和自噬抑制剂3-MA后,二甲双胍预处理介导的脑保护作用被完全和部分消除,证实二甲双胍预处理通过激活AMPK信号通路,诱导自噬活化而发挥脑保护作用。以上这些研究结果表明,脑缺血模型中,自噬的适度激活具有一定的保护作用;多种预处理均能够通过激活自噬减轻缺血/再灌注损伤,发挥脑保护作用。因此,自噬作为一种内源性保护机制,为lip诱导脑缺血耐受的研究提供了新思路。因此,本实验采用大鼠四血管闭塞全脑缺血动物模型,观察自噬小体和自噬表面标志性蛋白lc3在脑缺血/再灌注损伤中表达的变化,以及在lip诱导的脑缺血耐受中表达的变化,探讨自噬在lip诱导脑缺血耐受中的作用,为lip的脑保护作用提供实验依据,为临床上急性脑缺血疾病的防治研究提供新思路。方法与结果:1自噬在大鼠脑缺血/再灌注损伤中的表达1.1自噬小体在大鼠脑缺血/再灌注损伤中的表达动物分组及方法:21只雄性wistar大鼠永久凝闭双侧椎动脉恢复两天后,随机分为两组:(1)全脑缺血的sham组(n=3):只暴露双侧颈总动脉,不阻断血流;(2)全脑缺血(brainischemia,bi)组(n=18):夹闭双侧颈总动脉8min后恢复再灌注,根据再灌注时间的不同进一步分为bi0h、12h、1d、3d、5d和7d组。以上各组大鼠在sham手术后或全脑缺血/再灌注后相应时间点灌流固定取材,行透射电镜观察。透射电镜结果显示:全脑缺血的sham组,大鼠海马ca1区神经元核膜完整,核形态清晰,染色质分布均匀,胞质中细胞器丰富,形态正常,结构清晰,无自噬小体出现;全脑缺血后随着再灌注时间的延长逐渐出现胞质肿胀,线粒体水肿、嵴和膜融合,内质网、高尔基体扩张,核糖体从粗面内质网上脱落,染色质凝集、着边,偶有自噬小体出现,至再灌注后3d可以见到数量较多的自噬小体,线粒体两层膜分开、致密化,并出现线粒体空泡、畸形,粗面内质网扩张、脱颗粒,细胞器明显减少,核型不规则;再灌注后5d、7d细胞核固缩、崩解,核质胞质融为一体,无自噬小体出现。以上结果表明,全脑缺血/再灌注后大鼠海马ca1区神经元损伤,并激活自噬,再灌注后12h至3d可以见到自噬小体出现,之后自噬表达逐渐下降,细胞发生迟发性神经元死亡。1.2自噬表面标志性蛋白lc3在大鼠脑缺血再灌注损伤中的表达动物分组及方法:35只雄性wistar大鼠永久凝闭双侧椎动脉恢复两天后,随机分为两组:(1)全脑缺血的sham组(n=5):只暴露双侧颈总动脉,不阻断血流;(2)bi组(n=30):夹闭双侧颈总动脉8min后恢复再灌注,根据再灌注时间的不同进一步分为bi0h、1h、6h、12h、24h和48h组。以上各组大鼠在sham手术后或全脑缺血/再灌注后相应时间点断头取材,应用westernblot方法检测lc3的表达。westernblot结果显示:全脑缺血的sham组大鼠海马ca1区检测到微弱的lc3-Ⅱ条带,说明海马ca1区正常情况下存在自噬的低水平激活;与全脑缺血的sham组相比,全脑缺血后各组海马ca1区lc3-Ⅰ蛋白的表达未发生明显改变,而lc3-Ⅱ蛋白的表达逐步上调,至12h达峰值(p<0.05),之后逐步下降。上述结果表明,遭受全脑缺血打击的大鼠,海马ca1区lc3-Ⅱ蛋白的表达于再灌注后逐渐上调,呈现出动态的变化,12h达到高峰,之后逐渐减少,提示自噬被诱导激活。2自噬在肢体缺血预处理(limbischemicpreconditioning,lip)诱导的大鼠脑缺血耐受中的作用2.1自噬小体在lip诱导的大鼠脑缺血耐受中的表达动物分组及方法:12只雄性wistar大鼠永久凝闭双侧椎动脉恢复两天后,随机分为四组:(1)sham组(n=3):只暴露双侧颈总动脉,不阻断血流;(2)bi组(n=3):夹闭双侧颈总动脉8min后恢复再灌注;(3)lipsham+bi组(n=3):暴露双侧股动脉50min后,夹闭双侧颈总动脉8min后恢复再灌注;(4)lip+bi组(n=3):夹闭双侧股动脉10min、再灌注10min,反复三次,之后立即夹闭双侧颈总动脉8min后恢复再灌注。以上各组动物均于末次手术后3d灌流固定取材,行透射电镜观察。透射电镜结果显示:sham组大鼠海马ca1区神经元核膜完整,核形态清晰,染色质分布均匀,胞质中细胞器丰富,形态正常,结构清晰,无自噬小体出现;bi组海马ca1区神经元内可见数量较多的自噬小体,线粒体肿胀,出现空泡、畸形,细胞器明显减少,核型不规则;与bi组比较,lip+bi组神经元内自噬小体增多,神经元水肿减轻,线粒体较正常,细胞器尚丰富,核膜完整,核型规则;而lipsham+bi组神经元损伤程度与之无显著差别。以上结果表明,lip通过上调自噬小体的表达发挥了脑保护作用。2.2自噬表面标志性蛋白lc3在lip诱导的大鼠脑缺血耐受中的表达动物分组及方法:20只雄性wistar大鼠永久凝闭双侧椎动脉恢复两天后,随机分为四组:(1)sham组(n=5):只暴露双侧颈总动脉,不阻断血流;(2)bi组(n=5):夹闭双侧颈总动脉8min后恢复再灌注;(3)lipsham+BI组(n=5):暴露双侧股动脉50 min后,夹闭双侧颈总动脉8 min后恢复再灌注;(4)LIP+BI组(n=5):夹闭双侧股动脉10 min、再灌注10 min,反复三次,之后立即夹闭双侧颈总动脉8 min后恢复再灌注。以上各组动物均于末次手术后12 h取材,应用Western blot方法检测LC3的表达。Western blot结果显示:各组海马CA1区LC3-Ⅰ蛋白的表达无明显变化;sham组大鼠海马CA1区检测到微弱的LC3-Ⅱ条带;与sham组相比较,CA1区LC3-Ⅱ在BI组的表达明显增强,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显增高(P<0.05);与BI组比较,LIP+BI组海马CA1区LC3-Ⅱ的表达显著增多(P<0.05),而LIP sham+BI组海马CA1区LC3-Ⅱ的表达无明显变化。以上结果表明,LIP通过上调自噬表面标志性蛋白LC3-Ⅱ的表达发挥了脑保护作用。结论:1大鼠全脑缺血后,随着再灌注时间的延长,海马CA1区自噬小体和LC3的表达均呈现出动态的变化,早期逐渐增多,达到高峰后逐渐减少,细胞发生延迟性神经元死亡。2 LIP能够上调大鼠海马CA1区自噬小体和LC3的表达,进一步激活自噬,提高神经元对抗缺氧缺血打击的能力,减轻脑缺血/再灌注损伤。