目的:为获得钛种植体和骨组织之间早期的骨结合,众多研究者探索通过钛表面改性技术来提高其生物相容性和生物活性以实现早期的骨结合,而阳极氧化是表面改性的重要方法之一。本课题主要研究纯钛钛片阳极氧化改性后的表面微形貌和生物学特性及其对小鼠前成骨细胞(MC3T3-E1)骨保护素(OPG)m RNA表达的影响,从分子生物学和细胞角度探讨生物材料表面改性后的生物学特性与MC3T3-E1生物学行为的相关性。材料和方法:1.10 mm×10 mm×1 mm医用纯钛片用1 000目碳化硅砂纸打磨抛光后分别在丙酮,乙醇和去离子水中用超声清洗5min,干燥后备用。使用钛板做为阳极,石墨(40 mm×40 mm×5 mm)作为阴极,阳极和阴极之间的距离为40 mm,电解液为1 mol/L的氟化钠溶液,室温在直流(DC)电压源下,在10 V恒定电压对磨光钛片阳极氧化1h制备纳米管结构钛试样,在20 V恒定电压对磨光钛片阳极氧化20min制备实验组纳米孔结构钛试样。实验分为3组分别记为PO,NT和NP组,每组8个试样。对照组PO:磨光后的光滑钛片实验组NT:磨光后10 V恒定电压阳极氧化1h的钛片实验组NP:磨光后20V恒定电压阳极氧化20 min的钛片2.扫描电子显微镜(SEM)观测三组试样表面形貌,原子力显微镜(AFM)观察三组试样表面粗糙度,接触角测定仪测量接触角显示亲水性能。将三组试样于模拟体液(SBF)中浸泡2周后SEM观测表面类骨质羟基磷灰石的生长情况,并使用X线衍射仪(XRD)检测物相组成。3.三组试样消毒后放入24孔板内,将MC3T3-E1小鼠前成骨细胞接种于试样表面,分别在含10%胎牛血清、3%青链霉素混合液的alpha-MEM培养液1 m L,37℃、体积分数5%CO2环境下培养,培养1,4,7天后,分别进行MTT检测。并在培养7天后扫描电镜观察细胞形态。4.三组试样消毒后放入24孔板内,将MC3T3-E1小鼠前成骨细胞接种于试样表面联合培养7天后,提取细胞内RNA,采用RT-PCR对成骨细胞内目的基因OPG进行定性检测,采用荧光定量PCR对OPG m RNA的表达水平进行定量分析。结果:1.扫描电子显微镜显示:对照组PO磨光后的光滑钛片表面呈现均匀、光滑的表面特性;实验组NT钛试样表面形成一层规格统一的纳米管结构,纳米管的直径大约为70 nm;实验组NP的钛试样表面则形成一层规格统一的纳米孔结构,纳米孔的直径大约为20 nm。原子力显微镜显示阳极氧化后的实验组NT,NP表面粗糙度较对照组PO均有增加,PO组表面粗糙度为40±5nm,NT组表面粗糙度为200±11nm,NP组表面粗糙度为136±7nm。接触角测定仪测定实验组NT,NP的接触角较对照组PO均有减小,PO组接触角的平均值为91°±1°。NT组接触角的平均值为32°±2°,NP组接触角的平均值为72°±2°。三组试样在SBF中浸泡两周后,对照组没有新的物质生成,而实验组NT和实验组NP试样表面均有明显的类骨磷灰石形成,但两组之间无明显差异。2.MC3T3-E1接种于三组钛试样表面,经MTT细胞增殖实验结果显示在细胞培养第1天时三组试样之间的细胞数目差异不大(P>0.05);在7天的培养过程中,细胞逐渐增殖,数目显著增多。在培养到第4天时,光滑钛片和阳极氧化钛片表面细胞增殖有显著差异(P<0.05),NT组细胞增殖较NP组更快。在培养到第7天时,实验组的细胞增值数目约为对照组的两倍,而NT组与NP组细胞数目无太大差别。培养7天后,SEM显示实验组NT和实验组NP钛试样表面细胞形态较对照组PO增殖和分化的更好,并可见更加发达的丝状伪足。3.对照组表面成骨细胞的护骨素基因表达低于实验组NT和实验组NP的成骨细胞的护骨素基因表达(P<0.05),实验组NT成骨细胞的护骨素m RNA基因表达增加为对照组的3.7倍(P<0.01),实验组NP成骨细胞的护骨素m RNA基因表达增加为对照组的2.6倍(P<0.01)。结论:1.阳极氧化可以改变钛试样表面形貌,能形成统一的纳米结构,但不同条件下形成纳米结构的管径存在差异。阳极氧化形成的纳米管和纳米孔结构均可以提高钛表面的粗糙度及亲水性,且纳米管改性的效果更加理想。SBF实验表明改性后的纳米结构表面可以获得类骨磷灰石沉积,增强了钛的生物活性。2.阳极氧化改性的钛表面有利于细胞的粘附和增殖,表明阳极氧化形成的纳米结构表面对细胞行为具有积极作用,具有良好的生物相容性。纳米管较纳米孔更利于成骨细胞的粘附与增殖可能与纳米管能更好的提高钛表面的粗糙度及亲水性有关。3.阳极氧化改性的钛表面成骨细胞标记基因OPG的表达上调。纳米管结构表面的OPG的上调更加明显,OPG基因表达的增加利于成骨细胞的分化,加速骨结合形成,提高了钛片的生物活性和生物相容性。4.阳极氧化可作为钛合金种植体表面改性中一种很有前途的方法,从而获得良好性能种植体材料加速骨整合。