前言:核酸是最重要的生物大分子之一。它是遗传信息从亲代向子代传递的物质基础。在细胞中,核酸的合成、切割、连接、变构、修饰等众多反应无时不在,对于维持正常基因组的复制和修复、实施基因表达的调控具有重要的作用。包括聚合酶、内切酶、连接酶、重组酶在内的多种酶类参与了这些反应。由于这些核酸作用酶类独特的酶促活性,它们成为许多基础研究和应用研究中的重要工具酶。其中DNA聚合酶和限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,RE)是应用最为广泛的两种酶。　　 DNA聚合酶催化引物延伸反应。它遵从碱基互补配对原则,以单链DNA为模板,将引物的3末端不断延伸,形成与模板链互补的双链。通过‘解链—退火一延伸’的多次循环,DNA聚合酶可以使DNA模板得到上百万倍的扩增,实现扩增微量核酸样品的目的。聚合酶的应用以及聚合酶链反应(polymerase chainreaction,PCR)技术的发明极大地推动了核酸研究的发展和进步。然而,即使在最常见的DNA聚合酶引物延伸反应中,依然有许多尚未解决的问题。DNA聚合酶所能聚合的最短引物长度是多少?不同聚合酶聚合所需的最短引物长度是否相同?聚合酶在催化短引物时有何反应特性?催化效率受哪些因素的影响?这些问题都有待系统的研究。　　 限制性核酸内切酶,特别是Ⅱ类限制性核酸内切酶,可以识别特定的核酸序列,并在特定的位点切断核酸双链,形成粘性末端或是平端切口。限制性核酸内切酶广泛的应用在分子克隆、基因工程、合成生物学中。另一方面,近些年来,核酸化学在合成新的核苷酸方面取得了巨大的进步。这些新合成的核苷酸衍生物可以提高核酸的双链亲和力、提高识别错配碱基对的能力、改善对体内核酸酶的抵抗力等。由于这些优点,它们在反义核酸领域得到了应用。但是核苷酸衍生物对限制性核酸内切酶的影响研究却十分有限。　　 本论文将探讨KF(Klenow fragment)和Taq DNA聚合酶在短引物延伸反应中的催化特性,以及几种核苷酸衍生物(2甲氧基核苷酸、2氟核苷酸、5-甲基胞嘧啶核苷酸等)对限制性核酸内切酶EcoRI酶切反应的影响。　　 材料与方法:　　 不同长度的寡核苷酸(oligonucleotide,ON)形成两组模板引物复合物(T/Pcomplex),作为聚合酶的底物。一组T/P复合物带有一个5突出末端作为引物延伸的模板。另一组T/P复合物具有两个5突出末端,聚合酶可以向两个方向延伸。T/P复合物的聚合产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gelelectrophoresis,PAGE),和银染色分析,凝胶条带的灰度值计算聚合效率。荧光共振能量转移实验(fluorescence resonance energy transfer,FRET)用来分析限制性核酸内切酶的切割效率。内切酶的底物由三条寡核苷酸单链组成,分别是带有EcoRI识别序列的模板链(T-ON),5末端标记荧光发射基团的寡核苷酸(F-ON),3末端标记荧光淬灭基团的寡核苷酸(Q-ON)。当F-ON和Q-ON结合于T-ON形成双链时,荧光发射基团紧邻淬灭基团,因而不能发射荧光。当双链底物识别序列被EcoRI切断后,F-ON的5末端游离出来,进而发出荧光。不同核苷酸衍生物在不同位点取代T-ON,它们对EcoRI切割的阻滞作用通过荧光信号的变化进行测定。　　 结果:　　 KF聚合酶和Taq DNA聚合酶完成聚合反应所需的最短引物长度分别为6～7 nt和8 nt。当引物长度大于聚合所需的最短引物长度时,随着引物长度的增加,KF聚合酶对短引物的聚合效率增加,即9 nt引物的聚合效率最高,依次是8 nt引物和7nt引物。　　 引物5末端的单链结构有助于短引物聚合反应的发生,该结构可以使KF聚合酶聚合所需的最短引物长度由7 nt降低为6 nt。结合KF的晶体结构数据,该现象的可能原因是:聚合酶thumb结构域的loop结构与模板引物复合物的上游单链区域发生了相互作用,稳定了酶-底物复合物。　　 错配的位置会影响聚合效率。错配位置越接近3末端,短引物的聚合效率越低,错配位置越接近5末端,短引物的聚合效率越高。5末端错配引物的聚合效率与相同长度正配引物的聚合效率相近。　　 短引物聚合反应中,KF和Taq DNA聚合酶的最适温度分别为30℃和45℃。最适温度的降低,尤其是Taq DNA聚合酶,可能与温度升高导致底物双链的稳定性下降有关。　　 使用荧光共振能量转移实验可以有效的检测限制性内切酶的酶切活性。此方法具有高灵敏度、实时监测以及操作方便等优点。实验结果显示酶浓度与反应初速度之间具有良好的线性关系。　　 2甲氧基核苷酸(2-OMeNA)以及2氟核苷酸(2-FNA)对EcoRI识别序列5-GAATFC-3取代的酶切阻滞效应均具有位点依赖性。2甲氧基核苷酸取代T5位点的阻滞效应最强,然而取代G1和C6位点几乎没有酶切阻滞。2氟核苷酸取代C6位点不能有效的阻滞酶切,但取代A1～T5位点均可以不同程度的阻滞酶切。　　 2甲氧基核苷酸或2氟核苷酸对EcoRI识别序列临近2个位点的取代也具有较强的酶切阻滞作用。　　 不同类型核苷酸衍生物对同一位点的取代具有不同的酶切阻滞效应。G1位点的取代,2甲氧基核苷酸没有明显酶切阻滞,2氟核苷酸,6甲基鸟嘌呤核苷酸(6-Me-dG)可以阻滞酶切反应。C6位点的取代,2甲氧基核苷酸、2氟核苷酸、5甲基胞嘧啶核苷酸(5-Me-dC)均不能阻滞酶切。相反,A2位点的取代,2甲氧基核苷酸、2氟核苷酸、锁核苷酸(LNA)均可以不同程度的阻滞酶切。　　 结论:　　 实验结果显示KF和Taq DNA聚合酶在短引物延伸反应中具有一些与普通引物不同的反应特性。不同类型聚合酶以及不同类型T/P复合物聚合所需的最短引物长度不同。结合晶体结构数据,我们给出模型解释了引物5末端对聚合反应的影响。其它的因素,包括引物长度、错配位置、温度均会影响聚合效率。这些特性有助于我们更好地了解聚合酶的聚合反应机制,分析聚合酶与底物的相互作用以及为聚合酶活性检测开发更好的技术方法。　　 在论文的第二部分,我们发现不同核苷酸衍生物对限制性核酸内切酶EcoRI具有不同程度的酶切阻滞效应,并且具有取代位点的依赖性。通过分析限制性核酸内切酶EcoRI的空间结构以及EcoRI氨基酸侧链与DNA双链底物的相互作用,我们对所观察到的现象给予了解释。这些结果为我们提供了第一手的信息,帮助我们理解结构变化如何影响核酸酶与底物的相互作用。这些实验结果也为我们提供了调节限制性核酸内切酶活性的新途径,有助于在合成生物学中用于构建新的生物系统。