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一、背景肝癌是世界上第二位的导致与肿瘤相关死亡的因素。据统计,全世界每年确诊的肝癌达78万例,同时导致75万患者死亡。肝癌起病隐匿,没有特殊的临床症状,发现时常常已达中晚期。同时,肝癌预后不良,五年生存率低,且容易复发。因此,明确肝癌发生的机制对于指导临床治疗肝癌患者至关重要。肿瘤干细胞理论认为,肿瘤干细胞在肿瘤发生的过程中起决定性的作用。近年来,交感神经调控在肿瘤发生过程中所扮演的角色逐渐重新吸引研究人员的关注。此外,新近的研究报道,在肺癌和黑色素瘤等恶性肿瘤中交感神经兴奋可以通过调控肿瘤干细胞相关特性促进肿瘤的发生。本课题组前期的研究发现交感神经兴奋与肝癌的发生密切相关,DEN诱导肝癌发生过程中肝癌干细胞标记物CD133、CD90等与交感神经活性有密切的相关性。然而,交感神经是否能够调控肝癌细胞的干性相关特征还未见相关报道。二、目的明确交感神经兴奋是否能够调控肝癌细胞的肿瘤干细胞相关特性,并且初步明确相关的分子机制。三、方法1.利用免疫组织化学法检测本课题组前期DEN诱导肝癌发生模型,阻断交感神经活性的肝癌组织中肝癌干细胞标记物CD133的表达水平,研究交感神经活性与CD133表达水平的相关性。2.体外培养Huh7和PLC人肝癌细胞株,通过去甲肾上腺素模拟交感神经兴奋刺激肝癌细胞,RT-PCR和Western blot实验检测去甲肾上腺素刺激肝癌细胞后对CD133表达水平的影响。3.体外培养Huh7和PLC人肝癌细胞株,利用去甲肾上腺素模拟交感神经兴奋处理肝癌细胞,将实验分为四个组,包括对照组、去甲肾上腺素处理组、去甲肾上腺素加哌唑嗪阻滞组和单独使用哌唑嗪处理组。通过细胞增殖实验、肿瘤细胞球形成实验和细胞克隆形成实验检测去甲肾上腺素对Huh7和PLC肝癌细胞干性相关特征的影响;同时,哌唑嗪阻断肾上腺素能受体的作用,观察哌唑嗪阻断后Huh7和PLC肝癌细胞系干性特征的变化。4.利用交感神经兴奋模型,通过构建裸鼠皮下肝癌移植瘤模型,检测交感神经兴奋对肝癌细胞裸鼠皮下成瘤能力的影响。5.去甲肾上腺素模拟交感神经兴奋处理Huh7和PLC肝癌细胞,同时哌唑嗪阻断肾上腺素能受体的作用,通过RT-PCR和Western blot实验检测去甲肾上腺素对Huh7和PLC肝癌细胞中肿瘤干细胞相关基因表达水平的影响,初步明确去甲肾上腺素调控肝癌细胞干性特征的相关信号通路。四、结果1.通过免疫组织化学染色法检测本课题组前期DEN诱导的小鼠肝脏原位肿瘤组织,发现交感神经调控促肝癌发生的进程与肝癌干细胞标记物CD133表达水平升高密切相关,阻断交感神经活性抑制肝癌组织中CD133表达。2.利用去甲肾上腺素模拟交感神经兴奋处理Huh7和PLC肝癌细胞后,通过RT-PCR和Western blot实验检测发现去甲肾上腺素刺激Huh7和PLC肝癌细胞后CD133表达水平上调。3.去甲肾上腺素刺激Huh7和PLC肝癌细胞,肝癌细胞增殖能力、细胞球形成能力和克隆形成能力显著增强;哌唑嗪阻滞肾上腺素能受体后,Huh7和PLC肝癌细胞的增殖能力、成球能力和克隆形成能力减弱;单独使用哌唑嗪处理Huh7和PLC肝癌细胞其增值能力、成球率和克隆形成率较对照组没有显著差异。4.通过构建肝癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型,研究交感神经兴奋对肝癌细胞成瘤能力的影响,发现交感神经兴奋可以促进肝癌细胞成瘤。5.去甲肾上腺素处理Huh7和PLC肝癌细胞,肝癌细胞中Sox4的表达显著上调,而其他肿瘤干细胞相关基因表达水平没有明显变化;哌唑嗪阻断肾上腺素能受体后,Sox4表达水平下降;单独使用哌唑嗪处理肝癌细胞后Sox4表达没有明显变化。同时p-Akt表达水平伴随Sox4上调也有所增高,哌唑嗪阻断肾上腺素能受体后,p-Akt表达水平下调,而Akt没有显著的改变。五、结论1.交感神经调控促肝癌发生的进程与肝癌干细胞标记物CD133表达水平升高密切相关。交感神经兴奋可能调控肝癌细胞干性相关特性的改变。2.去甲肾上腺素模拟交感神经兴奋刺激肝癌细胞后,CD133表达水平升高,同时肝癌细胞增殖、成球和克隆能力显著增强;交感神经兴奋促进肝癌细胞裸鼠皮下成瘤;Sox4表达水平升高;p-Akt蛋白水平上调。去甲肾上腺素可能是通过激活PI3K/Akt信号通路上调Sox4的表达水平,从而增强肝癌细胞的干性相关特征。