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斑节对虾(Penaeus monodon)，是对虾属中最大型种，分布区域甚广，为当前世界上三大养殖虾类之一，也是我国重要的传统养殖虾类。在自然条件下，斑节对虾雌性性腺难以大批量集中成熟用于育苗生产，这是制约斑节对虾养殖业发展的重要因素。对斑节对虾繁殖与成熟的许多机理不是十分清楚，尤其是卵巢发育的分子调控机理研究不明；现有的催熟方法不利于亲虾重复使用，均制约斑节对虾养殖业的健康持续发展。本研究克隆与卵巢发育调控相关的功能基因——钙网蛋白基因和金属硫蛋白基因，并研究其表达调控及作用机理，为进一步开展斑节对虾卵巢发育相关基因的分子调控机理提供参考资料。
本实验采用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)从斑节对虾总RNA反转录产物中获得了1672bp的钙网蛋白(calreticulin,CRT)的全长cDNA序列，命名为Pm-CRT。该序列包含37bp的5’非编码区(UTR)和414bp的3’非编码区以及1221bp的开放阅读框(ORF)，可编码406个氨基酸。预测的分子量约为46.8kDa，理论等电点4.13。序列比对分析表明Pm-CRT与中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)的相似性和同源性最高，分别高达100％和98.8%。QRT-PCR(quantitative real time PCR)对组织表达检测的结果可知，Pm-CRT的mRNA在卵巢、肝胰腺、肌肉、脑、心脏、胃、眼柄和肠均有表达，卵巢的表达量最高，肌肉次之；对卵巢发育6期变化检测可知，Pm-CRT的mRNA在Ⅲ期卵巢表达量最高，Ⅰ期的表达量最低。为今后进一步研究该基因在斑节对虾卵巢发育中的作用提供基础材料。
本实验采用RACE-PCR方法从斑节对虾总RNA反转录产物中获得了502bp的金属硫蛋白(metallothionein,MT) cDNA序列，命名为Pm-MT。该序列5’-UTR长69bp，3’-UTR长256bp，ORF为177bp，可编码58个氨基酸。在其编码的氨基酸序列中半胱氨酸含量丰富，不含芳香族氨基酸，预测的分子量约为6.05kDa，理论等电点7.75。Pm-MT存在有无脊椎动物金属硫蛋白的特征序列CKCXXXCXCX，其N-末端保守序列则与其他甲壳类动物基本相同，具有高度保守性。序列比对分析表明Pm-MT与北美淡水蟹(Pacifastacus leniusculus)的相似性高达91.4%，与美国龙虾(Homarus americanus)的同源性最高为84.5%。实时定量PCR显示在所检测组织中，Pm-MT的mRNA在卵巢的表达量最高，其次为胃、肠、心脏、脑和肝胰腺；Pm-MT的mRNA在斑节对虾6个不同发育期的卵巢中的表达量都很高，其中在Ⅱ期卵巢中的表达量最高，而在Ⅰ期的表达量最低。根据Pm-MT基因的cDNA序列，利用普通PCR和染色体步移(Genome Walking)技术获得Pm-MT基因的全长序列，该基因序列DNA全长为2744bp，由2个内含子和3个外显子组成。其中启动子区域为806bp，2个内含子长度分别为1194bp和242bp，3个外显子长度分别为22bp、78bp和77bp。在启动子区域预测到糖皮质激素应答元件和雌激素应答元件两个与卵巢发育密切相关的转录因子。选取编码成熟金属硫蛋白的cDNA序列插入pTYB11质粒构建原核表达载体，通过诱导条件优化，经Western Blotting鉴定成功表达出预期大小的融合蛋白。为今后进一步研究该基因在斑节对虾卵巢发育中的作用奠定了基础。