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目的:通过测定糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D(GPI-PLD)基因在冠心病病人与正常人之间表达的差异,并同时利用GPI-PLD基因转染脐静脉内皮细胞HUVEC,初步研究GPI-PLD基因过度表达对氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)诱导HUVEC的影响,包括对其生长及凋亡、细胞膜上糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定的蛋白质、内皮细胞功能改变的影响,探讨GPI-PLD基因在动脉粥样硬化中的作用,为该基因的抗动脉粥样硬化研究提供初步理论依据。方法:1.分别取32名冠心病病人外周血和31名正常人外周血,测定其外周血GPI-PLD酶活性,分离外周血单个核细胞,提取RNA,测定GPI-PLD mRNA表达水平。2.用脂质体转染法将本室已经构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)/GPI-PLD转入HUVEC细胞,以未转染的HUVEC细胞及转染空载体pcDNA3.1(+)的细胞为对照,以G418筛选出阳性细胞克隆。RT-PCR法鉴定GPI-PLD基因的mRNA表达水平,利用自制具完整GPI结构的胎盘型碱性磷酸酶(PLAP)做底物,通过曲拉通-114(TX-114)分相,定量检测GPI-PLD活性;基因稳定转染后Ox-LDL诱导24小时,观察细胞生物学特性的变化包括MTT法检测各组细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期凋亡变化,RT-PCR检测内皮细胞HUVEC的T钙粘连蛋白(T-CAD)以及内皮素(ET)表达情况,硝酸还原法检测内皮细胞NO产生的变化,另外用Caspase3活性检测试剂盒检测各组细胞Caspase3酶活性,丙二醛(MDA)测定试剂盒、活性氧试剂盒检测各组细胞MDA和活性氧的含量等,并设立空白组和空载对照组。结果:1.病人组和正常对照组外周血GPI-PLD酶活性分别为30.71±4.61%,44.14±4.43%,两组差异有显著性(P＜0.05),外周单个核细胞GPI-PLD mRNA的相对表达量用积分分光密度比值(IA比值)表示分别为0.90±0.14,1.49±0.09,差异有显著性意义(P＜0.05)。2.RT-PCR结果和GPI-PLD酶活性测定表明,稳定高表达GPI-PLD的HUVEC细胞系已经建立。①G418筛选后,GPI-PLD稳定转染HUVEC细胞的GPI-PLD mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染组明显增高,差异有显著性(P＜0.05),。②GPI-PLD稳定转染HUVEC细胞后,GPI-PLD活性较转染空质粒组和未转染组明显增高,差异有显著性意义(P＜0.01),转染组细胞的GPI-PLD活性(%)达到13.50±0.89,而其它组细胞GPI-PLD活性极低,分别为0.40±0.07和0.35±0.09。3.氧化型低密度脂蛋白Ox-LDL诱导各组细胞前后的细胞生物学特性的变化。①MTT和细胞周期测定表明Ox-LDL诱导24小时后,GPI-PLD转染组细胞增殖能力明显强于转染空质粒组和未转染组。②GPI-PLD稳定转染HUVEC细胞后,抗脂质氧化能力增强,细胞内活性氧和丙二醛含量显著低于(P＜0.01)诱导后转染空质粒组和未转染组细胞,具有显著性差异。③诱导前各组细胞内皮素ET-1、T-CAD和NO表达无显著性差异,但诱导后GPI-PLD稳定转染HUVEC细胞内皮素ET-1表达显著低于诱导后空质粒组和未转染组内皮细胞组,NO和T-CAD表达高于诱导后空质粒组和未转染组内皮细胞组,差异有显著性(P＜0.05)。④各组内皮细胞诱导前,凋亡率无显著性差异,诱导后GPI-PLD稳定转染HUVEC内皮细胞组较空质粒组和未转染组凋亡下降,caspase3活性明显低于其它两组(P＜0.05)。结论:1.分析冠心病病人和正常人外周血GPI-PLD酶活性及mRNA表达,发现正常人较患者的GPI-PLD酶活性和mRNA水平都要高,差异具有显著性。2.成功将GPI-PLD基因转染入HUVEC内皮细胞,并在细胞中稳定表达。3.本试验证实GPI-PLD基因表达能够拮抗Ox-LDL对细胞的损伤作用。即通过上调GPI-PLD活性,释放GPI锚定蛋白如T-CAD等,降低内皮细胞对脂质敏感性,防止内皮细胞功能紊乱,抑制内皮细胞的凋亡,促进内皮细胞的增殖,修复细胞和血管的损伤。本试验为动脉粥样硬化基因治疗开辟了新的可能理论途径和方法。