拟南芥基质金属蛋白酶基因(At-MMPs)的调控及其功能的初步研究

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基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases,MMPs)是一类高度保守的依赖于锌离子的肽链内切酶,广泛地存在于动植物中。哺乳动物MMP的主要功能是降解细胞外基质中的胶原等大分子物质,在肿瘤细胞的转移等重大疾病的发病过程中起重要作用。植物MMP的功能研究则较为滞后,人们对植物MMP的了解远不如动物MMP深入。丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinase,MAPK)级联是真核生物中保守的信号转导通路,在植物的生长发育和抵抗生物及非生物胁迫等许多生理过程中,通过蛋白质的多级磷酸化,将内源和外源的信号汇集并向下传导,启动相关基因的表达。拟南芥At-MMPs家族共有5个成员。在我们的基因芯片数据分析中,我们发现当拟南芥MAPK信号通路(MKK4/5-MPK3/6)被激活后,At2-MMP和At3-MMP的表达急剧上调,表明At2-MMP和At3-MMP基因的表达可能受MAPK信号通路的调控。  在本研究中,为探究拟南芥MMP基因在植物生长发育和抗病过程中的调节机制,我们运用实时荧光定量PCR的技术,检测了在DD、Col-0等背景下和MAPK-WRKY33、JA、ET等主要的植物信号转导通路中At2-MMP和At3-MMP基因的表达。研究发现At2-MMP和At3-MMP基因的表达受MAPK的调控,MPK3和MPK6都参与At2-MMP和At3-MMP的表达上调,其中MPK3起着主导的作用。进一步研究表明,MPK3/MPK6调控植物抗病过程中的重要底物之一、转录因子WRKY33参与了At2-MMP和At3-MMP的基因表达调控。我们同时构建了PAt2-MMP: GUS报告载体系统,用于研究At2-MMP的表达和组织定位情况。GUS染色结果表明,At2-MMP在根、胚轴、叶脉等维管组织中表达较多。当拟南芥遭受Botrytis cinerea侵染时,At2-MMP被激活,且随着侵染时间的增加其表达量增加。  研究中还筛选到了拟南芥At-MMPs家族5个成员的单基因突变体及at2-mmpat3-mmp双基因突变体;通过抗生素筛选、Western Blot检测,获得了组成型和诱导型表达的At3-MMP过表达系统;构建了35S:At3-MMP-e YFP亚细胞定位载体。这些系统的构建为后续探索At-MMPs在拟南芥生长发育和抗病中的功能以及为探寻植物MMP的底物等相关研究在材料和方法上提供一些准备和借鉴,同时也对加深关于植物MMP的认识具有重要的意义。
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