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癌胚抗原(Carc inoembryonic antigen,CEA)是一种人类胚胎抗原决定簇的酸性糖蛋白,国内外已有大量文献报道,肺癌患者血清CEA水平明显高于正常对照组和良性肺病组患者,腺癌阳性率最高,因此CEA的监测有助于提高对早期肺癌诊断的敏感性(曾显声和周燕斌,2007)但肺癌早期患者血清中的CEA含量极低,因此需建立高灵敏度的蛋白质检测方法。随着纳米科技的兴起,纳米金以其独特的光学和电学性质、良好的稳定性、小尺寸和表面效应以及独特的生物亲和性,使其在疾病诊断领域显示了潜在的价值。目前,有关利用纳米金探针检测蛋白质的方法已有许多报道,但这些方法普遍操作繁琐费时、仪器昂贵,仅能在少数实验室应用。因此有待于进一步开发一些操作简便、可以通过普通仪器就可检测的、仍具有高灵敏度的纳米金探针检测蛋白质的方法。基于此目的,本研究构建了一种新型纳米金探针检测蛋白质的方法:在磁珠上标记捕获抗体CEA制备磁珠探针,同时利用纳米金对生物大分子的物理吸附特性,将检测抗体CEA与辣根过氧化物酶(Streptavidin-peroxidase,SA-HRP)标记于纳米金上制备成纳米金探针,检测过程中,磁珠探针、CEA抗原(检测目标)、纳米金探针三者通过免疫反应形成三明治复合结构,并利用磁珠的磁场效应收集复合结构,然后进行酶促显色反应,于450nm处进行分光光度检测,间接测定CEA抗原(检测目标)的含量,从而实现了通过普通光学仪器对蛋白质进行高灵敏度检测的目标。就该检测方法的建立本文主要做了以下一些工作:1.磁珠探针的标记及表征2.纳米金探针标记方法研究3.纳米金探针微量蛋白质测定方法研究结论:1.经荧光显微镜检测表明CEA抗体标记到了磁珠上,且免疫检测表明标记到磁珠上的抗体仍然具有活性。2.经最低蛋白稳定量实验确定纳米金标记蛋白质的最低稳定量为0.6μl。纳米金蛋白质检测方法的高灵敏度依赖于纳米金上酶标记数量的多寡。因此标记纳米金时检测抗体CEA与SA-HRP的加入量要进行试验优化。经试验表明检测抗体CEA(V):SA-HRP(V)的理想比例为0.5μl:5μl/100μl纳米金溶胶,在这种比例下既可以得到高的阳性A值而且阴性对照A值也会保持低的水平。另外纳米金探针重悬液的选择对于纳米金探针的活性及存储稳定性具有关键的影响。经试验表明50 mM Tris(pH 7.8,1.25%蔗糖,0.2%BSA,0.05%PEG,0.05%PVP,0.15%Tween 20)可以保持酶标纳米金探针的稳定性及标记物的蛋白活性和酶活性,是理想的纳米金探针重悬液。3.酶标纳米金探针微量蛋白质测定方法反应条件的优化:第一步孵育液为10mM PB(PH 7.4,1%BSA,5%蔗糖,1%PEG,1%PVP,0.3%ween 20),第二步孵育液为10 mM PBS(PH 7.4,0.1%BSA,0.05%Tween 20),酶标纳米金的加入量为3μl,两步孵育的最适时间为第一步孵育时间1h,第二步孵育时间45 min。使用该方法检测并绘制CEA标准曲线,表明CEA浓度在250 pg/ml—25 ng/ml区间时线性关系良好,R~2为0.991。通过灵敏度实验表明该检测体系的最低检测灵敏度为25 pg/ml,而传统ELISA方法的检测灵敏度仅为1.65 ng/ml,放免方法为1μg/ml,因此本研究达到了通过普通光学仪器进行高灵敏度蛋白质检测的目的。