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研究背景:研究发现恶性肿瘤的发生、发展、转移和复发的特点与正常干细胞极其相似。干细胞是一类未分化的细胞群,具有自我更新和多向分化能力,并保留非对称复制的生物学表型。大量研究表明,许多实体瘤及血液系统肿瘤起源于肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)。这种细胞具有自我更新、无限增殖、多向分化和在体内形成肿瘤的能力,并促进肿瘤不断生长,是肿瘤发生、复发和转移的根源。近十几年,已从多种肿瘤如白血病、乳腺癌、脑肿瘤、肺癌,前列腺癌、胰腺癌等分离并鉴定出CSCs,使肿瘤干细胞理论取得了实质性突破。肿瘤干细胞与肿瘤的多药耐药、肿瘤休眠及复发密切相关,从而抵制并逃避治疗,导致肿瘤耐药及进展。进一步探索CSCs在肿瘤形成、发展中的具体作用,对肿瘤的治疗有重要意义。卵巢癌病死率在女性生殖系统肿瘤中高居首位。上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer, EOC)在卵巢癌中所占比例最高,约90%卵巢癌来源于上皮。因其发病隐匿,早期无特异性症状,缺乏有效的早期诊断措施,大部分患者确诊时已多处于晚期,故死亡率高。最近,已有一些研究开始着眼于分离、鉴定正常卵巢组织及卵巢癌标本中的干细胞,并研究其干细胞特性。目前主要依据细胞表型特征和生物学特性来分离CSCs。无血清分离培养、流式细胞分选、磁珠分选等方法已成功应用于脑胶质瘤、乳腺癌、肺腺癌等CSCs的分离。其中,无血清培养已成为培养CSCs的经典培养方法。而卵巢癌干细胞的研究刚起步,国内外相关报道甚少。已有一些研究采用持续培养起始细胞、借鉴其它CSCs表面标志标记及染料排除方法,从卵巢癌患者腹水、肿瘤组织及一些细胞系中成功分离出一小群具有干细胞特性的肿瘤细胞亚群。目前已在多种肿瘤中发现一些与肿瘤发生、发展相关的分子表面标记物,并已成功应用于临床医学实践中。CD133是干细胞/肿瘤干细胞的特征性表面标志物之一,在脑肿瘤、肝癌、乳腺癌和结肠癌等肿瘤中己经证实CD133+细胞为CSCs。目的:建立一种体外无血清培养方法,从人上皮性卵巢癌细胞系A2780中分离、扩增卵巢癌干细胞。并通过体外连续传代培养,研究该细胞亚群体外自我更新、增殖、分化等生物学特性。对其卵巢癌干细胞的生物学特性和NOD/SICD小鼠体内致瘤能力进行初步鉴定。验证CD133、Oct-4、CD44等作为卵巢癌CSCs标志的合理性,为后续实验奠定基础。方法:采用体外无血清培养人上皮性卵巢癌细胞系A2780细胞,分离获得悬浮生长的肿瘤干细胞球样细胞,观察其生物学特性及细胞形态学变化;收集SFM培养中的A2780干细胞球样细胞,将其重悬于SSM内诱导其分化,观察细胞形态学变化;收集A2780干细胞球样细胞、诱导分化后细胞及常规培养的A2780贴壁细胞,经CD133抗体(APC-CD133)标记后,流式细胞仪检测三组细胞内的CD133阳性细胞比例;免疫细胞化学检测干细胞相关表面标志CD133、CD44、CD117在三组细胞内的表达情况;RT-PCR检测干细胞相关基因CD133、Oct-4、Nanog mRNA在三组细胞内的表达情况;将A2780干细胞球样细胞及常规培养的A2780贴壁细胞分别以细胞密度为1×104/ml、1×106/ml皮下接种于NOD/SCID小鼠两前肢腋下左、右两侧(0.1ml/部位),共6只,比较二者成瘤能力。结果:人上皮性卵巢癌细胞系A2780中有一小部分的肿瘤细胞可在SFM内存活、形成悬浮生长的细胞球,能连续增殖,可连续传代10代以上,成球比例随传代次数增多而增多,并可逐渐富集,具有自我更新能力。将A2780干细胞球重悬于SSM后出现分化,恢复其原先贴壁生长的特点,且分化后细胞形态与阴性对照无明显差别。流式细胞检测结果显示在第一、三、五、七代A2780球细胞内CD133阳性率分别为7.31%、20.20%、44.33%、92.69%,均显著高于常规SSM培养的A2780细胞1.16%及诱导分化后细胞1.35%。提示CD133阳性率随着传代的次数逐渐升高。而诱导分化前CD133阳性率为94.62%,诱导分化培养第7天细胞CD133阳性率为12.37%,第12天为1.35%,与阴性对照无明显差别。免疫细胞化学检测显示A2780干细胞球经鼠抗人CD133抗体标记后,细胞可见明显的绿色荧光,而CD44、CD117无明显表达。绝大部分常规培养的A2780细胞及诱导分化后细胞CD133、CD44、CD117均无明显表达。RT-PCR检测干细胞标志Oct-4、Nanog也在细胞球内较高表达,而常规培养的A2780细胞及诱导分化后细胞无明显表达或表达较低。SFM培养的第七代A2780卵巢癌肿瘤干细胞球样细胞接种于NOD/SICD小鼠,3周后开始成瘤,5周后所接种的6只NOD/SCID小鼠中6只成瘤。而SSM培养的A2780贴壁细胞接种5周后均未成瘤。CD133~+细胞具有更强的致瘤力。结论:无血清培养方法分离卵巢癌细胞系A2780的肿瘤干细胞简便易行,并可进一步扩增、富集卵巢癌CSCs,此法可作为分离、纯化卵巢癌CSCs的一种实用、简易且行之有效的方法。无血清培养法分离的人卵巢癌细胞系A2780干细胞球样细胞具有肿瘤干细胞特性:自我更新、多向分化和无限增殖等能力;并较SSM培养的贴壁细胞明显高表达CD133、Oct-4、Nanog等肿瘤干细胞标志,且CD133~+细胞具有更强的致瘤能力,提示CD133~+A2780细胞是卵巢癌CSCs。