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大蝎子草[Girardiniadiversifolia(Link) Friis]为贵州民间地方习用药材,主要用于治疗中风不语、咳嗽多痰、风湿疼痛、跌打损伤、骨折等。本研究利用膜技术对大蝎子草水提液进行膜截留,并对膜截留组分进行相关整体动物及细胞生物活性实验,寻找活性膜分离组分以及阐明作用机制。同时根据活性膜段的研究,进一步分析大蝎子草药材化学组份及质量研究,建立基于可能生物活性的大蝎子草药材质量控制标准。本论文主要分为两个部分: 1.大蝎子草膜分离组分生物活性研究 1.1目的: 通过对大蝎子草膜分离组分的抗炎、镇痛作用研究,寻找活性膜段,并对其抗炎作用机制进行探索性研究。 1.2方法: 1.2.1大蝎子草膜截留组分的制备 采用膜分离技术对大蝎子草水提液,按照分子量的不同进行膜截留,并对各截留段进行冷冻干燥。分别得到UF100、UF50、UF10、UF5、NF800、NF400、NF200及NF200以下8个组分。 1.2.2大蝎子草膜截留组分生物活性实验 采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀和醋酸致小鼠毛细血管通透模型评价不同膜分离组分的抗炎作用,采用小鼠热刺激致痛和醋酸扭体模型评价镇痛作用,寻找活性膜截留组分。 采用LPS刺激小鼠巨噬细胞,引起细胞发生炎症反应,通过蝎子草膜分离物干预作用深入研究炎症发生过程中的炎症介质 NO、NOS以及 TNF-α的变化,阐述其抗炎作用机制。 1.3结果: 实验结果显示,大蝎子草UF100及NF400组在小剂量时即能明显抑制二甲苯所致炎症反应及醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加;也对热及化学刺激致痛有显著抑制作用。这两组膜分离物也可以显著抑制巨噬细胞产生炎症介质NO、NOS及TNF-α。 1.4结论: 大蝎子草UF100及NF400组有较强的抗炎、镇痛作用,其抗炎作用可能与减少巨噬细胞释放NO、NOS、TNF-α等炎症介质有关。本研究为大蝎子草的进一步研究提供了基础和方向。 2.基于活性膜截留组分的大蝎子草药材化学成分及质量标准研究 2.1目的: 基于活性膜截留组分的研究,分析大蝎子草药材的化学成分及质量控制标准。 2.2方法: 采用柱层析、薄层层析、重结晶等方法分离纯化化合物并利用UV、IR、MS、核磁共振等方法鉴定化合物。采用紫外-可见分光光度法对药材中的总黄酮进行含量测定,以芹菜素为对照,检测波长为268nm;采用TLC法鉴别大蝎子草中东莨菪内酯;采用 HPLC法测定东莨菪内酯含量,以东莨菪内酯为对照,岛津 C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),乙腈-0.2%磷酸(25:75)为流动相梯度洗脱,流速1mL·min-1,检测波长298 nm,柱温30℃。 2.3结果: 分离鉴定出3个化合物,分别是东莨菪内酯、山柰素与β-谷甾醇。总黄酮含量测定,芹菜素在1.984~11.904μg·mL-1浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系,r=0.9999;平均加样回收率为96.15%,RSD为1.98%(n=6)。东莨菪内酯定性鉴别薄层色谱特征明显,东莨菪内酯含量测定的线性范围为0.022~0.352μg(r=0.9999),平均回收率(n=6)为92.93%(RSD1.86%)。 2.4结论: 化合物东莨菪内酯、山柰素为首次从该植物中分离。建立的质量检测方法简便、准确、重现性好,可用于大蝎子草药材的质量控制。