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背景(background):钩端螺旋体(简称钩体)分为致病性钩体和非致病性钩体两大类,前者引起人或动物疾病,后者属于非致病腐生性原核细胞型微生物。目前发现,致病性钩体可分为7个基因种,其中问号钩体基因种(Leptospira interrogans)流行最为广泛,如黄疸出血群、波摩那群、秋季群等；其次为波帕特森基因种(Leptospira borgpetersenii),如流感伤寒群。由致病性钩体感染引起的钩体病是全球流行的人畜共患传染病,中国及东南亚地区是钩体病流行的主要疫区,其次是巴西等南美地区国家。人类感染致病性钩体后,首先出现中毒性败血症症状,如高热、头痛、肌痛等；然后因钩体侵入肺、肝、肾等脏器及中枢神经系统,出现出血、黄疸及呼吸或肾功能衰竭症状,因主要受损脏器不同,临床上可分为六型,其中肺弥漫性出血(pulmonary diffuse hemorrhage, PHD)型钩体病死亡率高达50%～75%。以往生物学实验证明,致病性钩体不产生任何典型的外毒素,业已公布的2株致病性钩体全基因组序列中,也未发现有任何编码经典外毒素基因。致病性钩体脂多糖(LPS)的内毒素毒性仅为大肠杆菌LPS的1／10～1／100。尽管有文献报道,致病性钩体编码溶血素基因明显多于非致病性钩体,但仅凭溶血素难以解释致病性钩体强大的致病能力。因此,致病性钩体毒力因子及其致病机制至今所知甚少。近年发现,不少细菌具有毒素一抗毒素系统,该系统通常由一个操纵子中的两个基因编码,其中一个基因编码有毒性的核酸酶,另一个基因编码抗毒蛋白,抗毒蛋白能与核酸酶结合,使核酸酶失去毒性。目前认为,细菌毒素一抗毒素系统主要在营养缺乏等不利环境条件下,发挥利它性自杀功能,从而确保物种生存与延续。但最近有文献报道,大肠杆菌毒素一抗毒素系统可能在细菌致病过程中发挥作用。流行最广的问号钩体黄疸出血群赖型赖株基因组中,存在chpIK和mazEF两个操纵子,其表达产物可分别组成ChpI/ChpK和MazE/MazF两个毒素一抗毒素系统。然而,至今未见致病性钩体ChpI/ChpK和MazE/MazF毒素一抗毒素系统及其致病性的研究报道。目的(aim)：了解问号钩体黄疸出血群赖型赖株ChpI/ChpK和MazE/MazF两个毒素一抗毒素系统中的毒性蛋白ChpK和MazF的功能及其对人单核巨噬细胞株(THP-1)细胞和人肾小管上皮细胞(HEK293)的毒性作用。方法(methods):以致病性问号钩体黄疸出血群赖型赖株基因组DNA为模板,采用PCR扩增全长chpI、mazE基因及chpIK和mazEF操纵子片段,采用pET42a为表达载体、E. coli BL21DE3为表达宿主菌,分别构建上述基因及操纵子原核表达系统。采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图象分析系统检测目的重组蛋白rChpI、 rChpK和rMazE、rMazF表达情况及表达量,Ni-NTA亲和层析法提纯rChpI、rChpK和rMazE、rMazF。通过水解问号钩体赖株及THP-1细胞的基因组DNA和总RNA实验,了解rChpI、rChpK和rMazE、rMazF有无核酸酶活性。采用实时荧光定量RT-PCR,检测问号钩体赖株感染THP-1细胞前后chpI、chpK和mazE、mazF基因表达水平变化。采用Western Blot法,检测问号钩体赖株感染THP.1细胞前后ChpI、 ChpK和MazE、MazF表达及外分泌情况。采用免疫荧光标记及激光共聚焦显微镜,检测问号钩体赖株ChpI、ChpK和MazE、MazF在THP-1细胞内表达与外分泌情况。分别构建chpI、chpK和mazE、mazF基因真核表达载体并转染HEK-293细胞,采用CCK-8试剂检测ChpI、ChpK和MazE、MazF对细胞活性的影响。结果(results):所克隆的chpI、mazE基因及chpIK和mazEF操纵子核苷酸序列与文献报道完全相同。所构建的原核表达系统能分别表达rChpI、rMazE以及rChpI/rChpK、rMazE/rMazF蛋白。利用设置在chpl、chpK和mazE、mazF基因片段3’端6×His标签,不仅高效地提纯了rChpI、rMazE,同时也从rChpI与rChpK、 rMazE与rMazF昆合表达产物中提纯了毒性蛋白rChpK和rMazF,解决了因rChpK和rMazF毒性而不能在大肠杆菌中表达的难题。rMazF可水解RNA,但不水解DNA; rChpK既不水解RNA,也不水解DNA。实时荧光定量PCR结果显示,问号钩体赖株感染THP-1细胞后,chpI、chpK、mazE、mazF mRNAs水平显著升高。Western Blot结果显示,问号钩体赖株感染THP-1细胞后,ChpI、ChpK、MazE和MazF表达上调,毒性蛋白ChpK和MazF有外分泌的现象,抗毒性蛋白ChpI和MazE则否。问号钩体赖株感染的THP-1细胞胞质内可发现毒性蛋白ChpK和MazF,但未检测到抗毒蛋白ChpI和MazE。转染mazF基因的HEK293细胞活性明显下降并大量死亡,转染chpK基因的HEK293细胞活性也有所下降。结论(conclusion):ChpI/ChpK和MazE/MazF毒素-抗毒素系统可在问号钩体赖株感染宿主细胞过程中发挥作用：毒性蛋白ChpK和MazF蛋白在感染宿主细胞过程中外分泌并有明显的细胞毒性,MazF蛋白的RNA酶活性与其毒性密切相关,ChpK无DNA或RNA酶活性,其毒性作用机制有待于进一步研究。