嗜酸性喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus,A.是化能自养的硫氧化细菌,革兰氏阴性,能够以连四硫酸盐（S4O62-）、硫代硫酸盐（S2O32-）、亚硫酸盐（SO32-）、硫化物（S2-）和元素硫（S0）等多种还原性无机硫化物为能源进行生长。A.caldus生长的最适pH是2～2.5、最适温度是45℃,是一种中度嗜热菌,在生物冶金、煤的脱硫和含硫废水的处理等过程中具有重要的作用。A.具有复杂的硫代谢系统和调控网络,实现各种硫化合物的高效利用,而硫代硫酸盐的氧化是其整个硫代谢中的关键步骤,Sox硫氧化系统又是其硫代硫酸盐代谢中的重要途径。由于缺少Sox（CD）2,A.caldus中为不完整Sox硫氧化系统,由基因组上两个独立的基因簇sox-Ⅰ和sox-Ⅱ编码。其中,SoxYZ是底物结合蛋白,SoxAX可以催化底物结合并实现自身的还原,产生电子,SoxB则负责将SoxYZ末端的磺酸基团氧化成硫酸报。A.caldus中不完整Sox系统中SoxYZ的再生机制及工作方式,以及两套Sox系统是如何调控的,目前还没有报道。因此,基于无痕敲除等分子生物学技术,研究A.caldus中Sox系统的转录方式、基因敲除株的生长变化、代谢产物变化、硫氧化基因转录变化,对于解析Sox系统工作方式和调控机制具有重要意义,同时也可以深入了解A.caldus的硫代谢及其调控网络,揭示硫代谢的分子机制,为高效浸矿基因工程菌株的构建提供理论指导。本论文的工作主要从以下几个方面展开:一、A.culdus MTH-04中Sox硫氧化系统生物信息学及转录水平分析:通过对A.caldus基因组中两套sox基因簇sox-Ⅰ和sox-Ⅱ进行基因簇排列和组成的分析、比较发现,两套系统中核心组分SoxAX、SoxYZ和SoxB具有较高的相似性。对两套Sox系统中各蛋白进行系统发育分析发现,两套系统的Sox蛋白具有共同的进化来源。本文,首次发现sox-Ⅰ基因簇前有一个依赖转录因子sigma54的双组分调控系统A5904₂484和A5904₂485,将其组氨酸激酶命名为TspS,调控蛋白命名为TspR（Tsp,two component system（TCS）of Sox pathway）,并且在多个化能自养的硫氧化菌中发现了tspSR-soxXAYZB类型的基因簇。两套sox基因簇在硫粉和连四硫酸盐为能源时生长过程中基因转录变化分析发现,在连四硫酸盐培养时sox基因转录水平较高,但是sox-Ⅰ和sox-Ⅱ具有相反的变化趋势,说明两套系统功能的发挥可能受到不同方式的转录调控,从而在不同的生长时期发挥功能。二、A.caldus MTH-04中sox基因敲除菌株的构建:运用基于同源重组的无痕敲除方法,通过构建含有soxB-Ⅱ基因上下游同源臂和I-SceI酶切位点的自杀质粒pSDUDI::soxB-Ⅱ（UHA+DHA）,接合转移进入A.caldus野生型筛选得到单交换;向单交换中转入pSDU-I-Sce Ⅰ质粒促进同源重组,成功筛选得到 △soxB-Ⅱ 敲除株;通过构建自杀质粒 pSDUDI::soxYZB-Ⅱ（UHA+DHA）,在 △soxAX-Ⅱ的基础上敲除基因soxYZB-Ⅱ,成功构建△sox-Ⅱ敲除株,实现了对sox-Ⅱ基因簇的敲除。两种敲除株的成功构建为分析相应基因的功能奠定基础,但是,sox-Ⅰ处基因的敲除则经过大量的筛选,都未能得到其敲除株,推测其可能具有更加关键的基础性作用。三、A.caldus MTH-04 sox基因敲除菌株功能的研究:针对本文构建的敲除株△soxB-Ⅱ、△sox-Ⅱ和实验室已有的△soxYZ-Ⅱ、△soxX4-Ⅱ敲除株,从生长特性、转录水平和代谢物检测等方面进行了系统的研究分析。通过测定硫粉、连四硫酸盐、硫代硫酸盐为能源时的生长曲线发现,soxB-Ⅱ和sox YZ-Ⅱ的敲除对菌株生长影响不明显,敲除株△soxXA-Ⅱ和△sox-Ⅱ的生长明显弱于野生型,生长量不足野生型的一半;RT-qPCR分析敲除株AsoxB-Ⅱ、△sox-Ⅱ、△soxYZ-Ⅱ、△soxXA-Ⅱ中硫代谢基因转录变化发现,soxB-Ⅱ和soxYZ-Ⅱ的敲除可以通过另一套sox基因（sox-1）的上调弥补,因此,对整个菌株生长和代谢的影响不大。然而,soxXA-Ⅱ和sox-Ⅱ基因的敲除导致的基因缺失并不能通过另一套基因的上调实现补偿,且会影响tetH和doxD基因的转录,实现代谢途径由Sox系统向S4I途径的转化,导致能量代谢效率的下降,因而对生长的影响较大。高效液相色谱检测连四硫酸盐的消耗及元素硫产生的结果显示,连四硫酸盐消耗曲线与生长曲线的结果一致,sox基因敲除导致菌体元素硫含量的减少,其含量由高到低的顺序依次为野生型、△soxB-Ⅱ、△soxYZ-Ⅱ、△soxXA-Ⅱ和△sox-Ⅱ。硫代硫酸盐培养野生型产生单质硫,同时Sox系统的减弱导致元素硫产生的减少,因此,我们认为不完整Sox系统的活化再生可能是通过多聚硫的断裂,形成硫球实现SoxYZ的再生,实现整个硫代硫酸盐代谢途径的循环。四、A.caldus MTH-04中sigma因子与硫代谢及环境压力的关系:Sigma因子是细菌基因转录的关键,本章系统开展了不同硫能源培养条件和环境压力下A.caldus Sigma因子转录水平分析,并通过构建sigma54的过表达菌株验证其与Sox系统的关系。通过分析硫粉和连四硫酸盐为能源时的sigma因子的转录水平发现:所有的sigma因子在两种能源条件下都能检测到稳定表达,且sigma因子在生长过程中的转录水平不同,说明sigma因子在菌体生长过程中参与硫代谢等相关基因的转录调节。pH、热刺激、渗透压和铜刺激等环境压力条件下分析发现,持家基因的sigma因子也会参与到环境刺激条件下基因转录的调控,同一类别的sigma因子在A.caldus中可能参与不同的生长和刺激条件下的基因的转录的调控。通过对不同能源和不同环境压力条件下的分析,我们发现sigma54基因的转录处于相对稳定的水平,可能并未参与环境刺激相关基因的调控。同时,我们基于基因组序列分析发现sigma54依赖的双组分调控系统TspS和TspR,可能参与Sox系统的转录调控,因此我们构建了 基因的过表达菌株,以分析sigma54是否负责Sox系统的转录起始。通过对过表达sigma54的重组菌株的RT-qPCR分析,证实了其与sox-Ⅰ转录调控的关系,证明σ54可以激活sox-Ⅰ的转录。五、A.caldus MTH-04中σ54依赖的双组分调控系统TspS/R对sox-Ⅰ基因簇的调控:σ54（RpoN）类型的转录起始具有以下特点:识別启动子特异性的-12和-24区,需要激活蛋白参与,激活蛋白接合启动子上游的上游激活序列UAS,实现RNA聚合酶与启动子DNA复合休构象的改变。其中,sox-Ⅰ基因簇中的TspR蛋白既是双组分中的调控蛋白也是σ54的激活蛋白。首先,基于生物信息学分析发现A.caldus及其他化能自养菌中存在tspSR-sox类似的基因簇;通过快速扩增cDNA末端（5’RACE）确定.soxX-Ⅰ转录起始位点;运用凝胶阻滞分析（EMSA）分析TspR蛋白与不同大小的启动子P1的接合作用,确定UAS的区域;构建一系列的启动子探测质粒分析了不同大小的启功子和不同关键位点突变的启动子的活性,确定了启动子P1的-12/-24区保守的GC/GG,鉴定了UAS保守的TGT/ACA序列;基于双组分蛋白的序列和结构域的相似性及启动了-12/-24和UAS保守序列,通过生物信息学分析提出其它硫氧化菌株中类似调控机制的合理假设;基于实验结果和σ54依赖的转录起始的机制,首次提出了A.caldus中σ54依赖的双组分调控系统TspS/R对sox-Ⅰ基因簇的调控的模型。六、A.caldus MTH-04中sox-Ⅱ基因簇共转录分析及启动子初步鉴定:首先通过共转录分析确定sox-Ⅱ操纵子的组成,发现与sox-Ⅰ中只有一个操纵子不同,sox-Ⅱ中各个sox基因位于两个操纵子上，且基因簇附近未发现调控蛋白，因此我们首先对sox-Ⅱ中可能的启动了进行分析。共转录分析应有启动子和生物信息学及转录数据分析中可能的启动子通过启动了探测质位和5’RACE进行分析,成功构建四种启动子探测质粒 pJRD215-P2515-gusA、pJRD215-P2519-gusA、pjRD215-P2523-gusA 和pJRD215-P2525-gusA,并在体内验证了启动子的活性。结果发现,四种启动子均有转录活性。通过5’RACE试图确定四个基因的转录起始位点（TSS）,但只成功地确定了两个基因A5904₂515和A5904₂519的转录起始位点,因而,可以得到启动子可能的关键序列,初步解析了sox-Ⅱ的转录调控元件。