众所周知直接的辐射暴露会导致神经退行性变,但对于辐射的旁效应与神经毒性之间的关系尚未研究清楚,需要详细的机制研究。体内和体外研究都表明,中枢神经系统中的胶质细胞可以保护神经元在应激条件下不受损伤。在神经元与神经胶质细胞共培养的条件下,非直接的辐射暴露对神经元的调控,以及对神经胶质细胞保护作用的影响都有待研究。因此,本课题立意于评估辐射的非直接效应对于神经元退行性变的影响,以及在此过程中神经胶质细胞的保护作用。同时,我们也对辐射后的细胞释放出的因子对附近未受到直接辐射的细胞造成的损伤进行了研究。我们预测辐射的旁效应可能导致氧化应激的发生并诱导DNA损伤最终导致SH-SY5Y神经元凋亡。另外,共培养神经胶质细胞U87可能通过降低氧化应激和凋亡来抑制辐射的旁效应导致SH-SY5Y神经元受到的毒性作用。最后,我们用蛋白质组学的方法检测了辐射后的细胞的培养液,来鉴定可以作为非辐射细胞损伤信号指示的分泌蛋白。我们使用钴-60的γ射线作为直接的辐射源,并使用辐照细胞条件培养基(ICCM)来模拟辐射的间接影响。为了确定ICCM抑制神经细胞存活的效力,我们进行了集落形成测定和细胞活力测定。ICCM诱导神经细胞SH-SY5Y的细胞凋亡情况通过TUNEL法和Annexin V/PI进行了测定。氧化应激和炎性细胞因子的浓度的水平通过ELISA法进行了评价。直接和间接辐射暴露后关键凋亡蛋白的表达通过免疫印迹法进行了研究。为了评估胶质细胞对辐射的旁效应的神经保护作用;在ICCM中培养的SH-SY5Y细胞分别在有和没有胶质细胞U87的transwell共培养系统中培养。在不同的时间点,通过活细胞计数法,Annexin V/PI凋亡检测,细胞周期检测,Fas受体的m RNA水平检测(q RT-PCR),免疫印迹法和ELISA法对神经元SH-SY5Y细胞在ICCM暴露下有和没有与U87胶质细胞共培养进行了分析。同时,也进行了二维色谱和串联质谱蛋白质组学自下而上的(Bottom-up)分析研究。第一部分实验数据提示神经元SH-SY5Y细胞中ICCM抑制细胞存活,促进细胞凋亡,是时间和剂量依赖的。此外,在神经元SH-SY5Y细胞中,ICCM显著刺激释放细胞炎症因子,如肿瘤坏死因子TNF-α(P<0.01),白细胞介素-1(IL-1,P<0.001),和白细胞介素-6(IL-6,P<0.001),提升氧化应激的水平(MDA,P<0.01)。上调关键凋亡蛋白的表达,如,Bax蛋白,Bid蛋白,细胞色素C,caspase-8和caspase-3,证实了ICCM对神经细胞的毒性。我们的研究显示,ICCM会引起氧化应激显著增加,并降低线粒体膜电位。此外,ICCM引起SH-SY5Y细胞DNA损伤,在S期细胞周期停滞显著增加(***P<0.001),过表达P53蛋白会进一步证实了这一点的(**P<0.01)。因此增加FAS基因的表达和上调的关键凋亡蛋白都证明ICCM会导致SH-SY5Y细胞的凋亡。本研究的第二部分,为了研究神经胶质细胞的存在下辐射对神经元细胞的旁作用,我们使用了Transwell共培养体系。我们的分析仍然集中在神经元细胞。数据结果表明,ICCM诱导的氧化应激在SH-SY5Y细胞与U87共培养后显著降低,其进一步帮助维持线粒体膜电位的完整性。神经细胞SH-SY5Y共培养后(与胶质细胞U87),显著降低ICCM诱导细胞的周期阻滞和P53的表达(###P<0.001)。细胞凋亡机制的研究显示,在共培养体系中;ICCM诱导的FAS m RNA表达水平显著减少(###P<0.001)同时显著降低凋亡关键蛋白表达即FADD(###P<0.001),caspase-8(###P<0.001),和降解的caspase-3(###P<0.001),与ICCM处理的不共培养的神经元SH-SY5Y细胞相比。有趣的是,共培养后神经营养因子,例如,GDNF,BDNF和抗氧化酶超氧化物歧化酶,谷胱甘肽水平增加,可能提示胶质细胞U87的保护机制。本研究的第三部分是鉴定通过蛋白质组学分析ICCM中的分泌蛋白条大约被鉴定道德17%的蛋白质为分泌颗粒和细胞外基质,而生物过程分析显示,22.2%被鉴定到的蛋白质参与运输和17.2%的蛋白质参与细胞内信号级联反应。本研究提供了证据表明,辐射的旁效应与直接辐射暴露相比对神经元细胞都有损伤效应。因此更多的分子水平的研究来评估辐射旁效应对中枢神经系统的风险可以较少治疗的不确定性与导致神经退行性变的可能。