一、研究背景华法林（warfarin）是香豆素类口服抗凝药，常用于人工瓣膜置换、血栓栓塞性疾病（如肺栓塞）及房颤的抗凝治疗。由于华法林有的较窄治疗窗口，在临床使用过程中，稳定治疗剂量在不同个体间的也不尽相同，如果给药量不足会导致血栓形成，同时，给药量过大将会增加出血风险，甚至危及生命。因此，为不同个体选择合适的抗凝方案，已成为心脏术后患者远期疗效重要的影响因素之一。近年来，随着华法林的药物基因组学研究的深入，人们发现某些基因的遗传变异，特别是华法林的药代学途径和药效学通路上的变异，可能是造成个体间华法林剂量差异的主要原因之一。在药代动力学方面，华法林是由R-和S-对映体组成的外消旋混合物，在肝脏中经细胞色素酶P450代谢为非活性产物，S-对映体经细胞色素氧化酶P4502C9（CYP2C9）酶代谢，而R-对映体则由CYP1A1、CYP1A2和CYP3A4酶代谢。其中S-华法林拮抗维生素K的能力是R-华法林的3~5倍，在稳定状态下，S-华法林能够发挥60%~70%的抗凝作用，并主要经CYP2C9酶代谢。CYP2C9是许多药物的重要代谢酶，其基因多态性可使酶活性降低，从而影响药物代谢动力学。在药效学方面，在维生素K环氧化物还原酶复合物（VKOR）的作用下，维生素K由环氧化转化成氢醌（KH2），VKOR由多个亚单位组成，其中亚单位1（VKORC1）具有激活VKOR的作用，也是华法林的作用靶点，华法林通过抑制VKORC1的活性，阻碍维生素K由环氧化物转化成氢醌，从而阻断凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ及抗凝蛋白C和S的活化达到抗凝的目的。当VKORC1基因突变后转录活性下降，抗华法林的能力降低，从而在药物效应动力学方面影响华法林的作用。因此研究基因多态性与华法林剂量需求的关系，指导个体化用药，具有重要的临床意义。相关研究发现，CYP2C9基因存在野生型（AA）、突变杂合型（AC）及突变纯和型（CC）三种分型；VKORC1-1639A/G基因有野生型（GG）、突变杂合型（GA）及突变纯和型（AA）三种分型；VKORC1-1173C/T基因有野生型（TT）、突变杂合型（CT）及突变纯和型（CC）三种分型。在国内，研究主要集中于CYP2C9基因及VKORC1-1639A/G基因，并且针对VKORC1基因单个位点的研究较多，而对该基因多个位点同时研究相对较少。但晚近研究发现，VKORC1-1173C/T基因多态性与华法林维持剂量存在密切联系，可能会是另一个影响华法林维持剂量的重要影响因素。因此，同时研究VKORC1-1639A/G基因及VKORC1-1173C/T基因多态性对华法林维持剂量影响的研究显得十分重要。二、研究目的1、观察细胞色素氧化酶P4502C9（CYP2C9）基因多态性在上海地区汉族人群中的分布以及对华法林维持量的影响。2、观察维生素K环氧化还原酶复合体1（VKORC1）基因多态性在上海地区汉族人群中的分布以及对华法林维持量的影响。3、观察年龄、性别、体重、CYP2C9和VKORC1基因型、华法林浓度等与华法林维持量的关系，以期望能产生一个新的个体化给药方案，从而为个体化、合理化指导性用药提供依据。三、研究对象及方法收集自2011年6月至2012年12月期间于上海长征医院胸心外科择期在体外循环（CPB）下行瓣膜置换手术的患者及门诊复查的心脏手术后患者共146例。所有患者均签署《华法林（warfarin）个体化用药检测知情同意书》，其抗凝强度的国际标准化比值（INR）维持在2.0-3.0。1、采用焦磷酸测序方法，通过抽取患者外周静脉血检测CYP2C9与VKORC1基因分型及其基因突变情况。2、通过UPLC/MS-MS法检测患者口服华法林后的血浆中华法林的总浓度及游离浓度。3、分别统计患者相关资料，包括年龄、性别、体重、凝血酶原时间（PT）、国际标准化比值（INR）、活化部分凝血活酶时间（APTT）等。4、通过综合分析基因多态性指标，血浆中血药浓度值以及患者的相关临床资料，最终评价不同影响华法林抗凝强度个体用药剂量差异的因素，推测不同患者适宜的起始剂量及稳定剂量。四、结果1、检验结果显示不同基因型组别之间性别、年龄、体表面积、体质量指数、吸烟、饮酒、基础心脏病、置换瓣膜的数量、置换瓣膜的部位、是否伴有糖尿病等均符合Hardy-Weinberg平衡定律；2、检测146例服用华法林的患者，其中CYP2C9基因型，发现野生纯和子AA型137例（93.8%），突变杂合子AC型9例（6.2%），未发现突变纯合子CC型（0.0%）；VKORC1-1639A/G基因型，发现野生纯合子AA型124例（85.1%），突变杂合子GA型22例（14.9%），未发现突变纯合子GG型（0.0%）；VKORC1-1173C/T基因型，发现野生纯合子TT型118例（81.2%），突变杂合子CT型28例（18.8%），未发现突变纯和子CC型（0.0%）。结果均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律（P>0.05），提示样本具有群体代表性；3、146例患者中，男性64例（43.8%），其为达到标准抗凝强度INR（2.0~3.0）所需华法林维持剂量为3.22±0.69mg/d，女性82例（56.2%）其为达到标准抗凝强度INR（2.0~3.0）所需华法林维持剂量为2.13±1.11mg/d，男性患者所需华法林维持量明显高于女性患者，其差异有统计学意义（P<0.05）；根据患者年龄分组发现，为达到标准抗凝强度，70岁以上（含70岁）患者华法林维持量为2.11±0.32mg/d，60-69岁患者华法林维持量为2.14±0.60mg/d，均小于其余各年龄组（50-59岁，2.69±0.77mg/d；40-49岁，2.89±0.25mg/d；30-39岁，2.64±0.18mg/d；20-29岁，2.58±0.59mg/d；≤19岁，2.75±0.71mg/d），其差异有统计学意义（P<0.05）；4、以抗凝强度指标INR维持2.0~3.0为标准，146例上海地区汉族人工瓣膜置换术后抗凝治疗患者中，CYP2C9（AA）基因型的患者华法林维持量为2.26±0.82mg/d，而CYP2C9（AC）基因型的患者华法林维持量为1.80±1.29mg/d。AA型患者华法林维持剂量明显高于AC型，其差异具有统计学意义（P<0.05）；VKORC1-1639A/G（AA）基因型的患者华法林维持量为1.76±0.57mg/d，VKORC1-1639A/G（GA）基因型的患者华法林维持量为3.32±1.02mg/d，AA型患者华法林维持量明显低于GA型患者，其差异有统计学意义（P<0.01）；VKORC1-1173C/T（TT）基因型的患者华法林维持量为1.81±0.63mg/d，VKORC1-1173C/T （CT）基因型的患者华法林维持量为3.33±1.04mg/d，TT型患者华法林维持量明显低于CT型患者，其差异有统计学意义（P<0.01）；5、146例上海地区汉族人工瓣膜置换术后抗凝治疗患者中，基因型为VKORC1-1639A/G（AA）型共124例，华法林维持剂量为（1.76±0.57mg/d），平均血浆华法林浓度为（596.1±249.6ng/ml），其次为VKORC1-1639A/G（GA）型，共22例，华法林维持剂量为（3.32±1.02mg/d），平均血浆华法林浓度为（951.4±411.4ng/ml）；而基因型为VKORC1-1173C/T（TT）型共118例，华法林维持剂量（1.81±0.63mg/d），平均血浆华法林浓度（605.8±269.1ng/ml），其次为VKORC1-1173C/T（CT）型，共28例，华法林维持剂量为3.33±1.04mg/d，平均华法林血浆浓度（963.0±378.4ng/ml），不同组间华法林口服剂量及血药浓度差异有统计学意义（P<0.01）。五、结论1、146例上海地区汉族人工瓣膜置换术后抗凝稳态患者中，60岁以上患者平均日维持量比60岁以下患者低，女性患者平均日维持量比男性患者低，其差异有统计学意义；2、上海地区汉族人中华法林抗凝药物剂量的个体间差异与CYP2C9基因多态性的不同有关。华法林维持剂量在CYP2C9（AC）、CYP2C9（AA）基因型的患者中呈递增状态，组间剂量相差明显；3、上海地区汉族人中华法林抗凝药物剂量的个体间差异与VKORC1基因多态性的不同有关。华法林维持量在VKORC1-1639A/G（AA）、VKORC1-1639A/G（GA）基因型的患者以及VKORC1-1173C/T（TT）、VKORC1-1173C/T（CT）基因型的患者中均呈递增状态，且各组间剂量相差明显；4、146例上海地区患者抗凝稳态华法林血药浓度的个体间差异性与VKORC1-1639A/G及VKORC1-1173C/T基因多态性有明显的相关性。VKORC1-1639A/G（GA）型患者稳态华法林血药浓度明显高于VKORC1-1639A/G（AA）型患者；VKORC1-1173C/T（CT）型患者稳态华法林血药浓度明显高于VKORC1-1173C/T（TT）型患者。因此，我们建议，为了获得最佳的治疗效果并最大程度降低治疗风险，有必要将CYP2C9、VKORC1（-1639G/A）及VKORC1（11173C/T）基因多态性的检测作为华法林给药剂量和维持剂量的指导依据。