l-薄荷醇是全球三大香料化学品之一,广泛用于医药、食品、烟草、化妆品及口腔保健等产品,年产量超过2万吨,价值高达5亿美元。由于受天气、地域的影响及全球经济的迅速发展,天然薄荷醇已经无法满足需求,因此化学合成方法称为解决这一问题的有效途径。但化学合成所得的产物是8个薄荷醇异构体的混合物(4对薄荷醇),需要通过拆分来制备l-薄荷醇。脂肪酶(lipase, EC3.1.1.3)是广泛存在于自然界生物体中的水解酶,其中来源于微生物的脂肪酶被广泛应用于医药、精细化工、食品、造纸、纺织以及皮革加工等工业领域。在催化特性上,微生物脂肪酶能够催化水解反应及其逆过程,并且具有稳定性高、选择性好以及不需要辅酶等优点,因此得到愈来愈多的研究与应用。虽然产脂肪酶的微生物比较容易发现,但获得满足工业应用要求的优良脂肪酶产生菌却存在一定困难。本文以酶促拆分制备l-薄荷醇为目标,筛选获得了能够耐受有机溶剂并具有较高立体选择性的脂肪酶。其中嗜麦芽糖寡养单胞菌脂肪酶,能够特异性地催化l-薄荷醇与乙酸乙烯酯发生转酯化,并且在常见有机溶剂中保持较高稳定性,因此能够实现在工业条件下对4对薄荷醇混合物来拆分制备高纯l-薄荷醇的目的。论文的主要工作包括以下五个部分：第一,非水相中立体选择性拆分l-薄荷醇脂肪酶的筛选。构建双液相荧光筛选体系,能够快速定量地筛选来源于OSS微生物的OST脂肪酶,这一方法拓宽了OST脂肪酶的微生物来源。以橄榄油为唯一碳源,从土壤中筛选得到4328个产脂肪酶的微生物,然后通过高通量筛选方法从中复筛得到21个不同种属来源的耐有机溶剂脂肪酶,其中10个脂肪酶来源于OSS微生物。通过对这些脂肪酶在甲苯中拆分4对薄荷醇结果的考察,获得一个能够高立体选择性催化薄荷醇转酯化的脂肪酶——嗜麦芽糖寡养单胞菌(保藏号CGMCC No.4254)脂肪酶。第二,嗜麦芽糖寡养单胞菌的产酶过程以及脂肪酶(简写SML)的催化特性的研究。嗜麦芽糖寡养单胞菌脂肪酶目前未见详细的研究报道,因此研究首先优化了培养基组成以及发酵条件,转酯化拆分4对薄荷醇的单位发酵液酶活为62.3U/L,较优化前的产酶量提高了10倍。然后通过纯化步骤,获得了电泳纯的脂肪酶样品(比活力38.9U/mg). SML对中、长链脂肪酸酯底物的水解活力较高,在5℃下保持最大活力的57%,在高于40℃条件下不稳定,在5-35℃范围内的反应活化能Ea=3.25kcal/mol,属于低温脂肪酶。该酶在50%和100%(v/v)疏水性有机溶剂中保存7天后,依然能够保持全部酶活力。采用纯化的SML催化100 mM的4对薄荷醇与乙酸乙烯酯发生立体选择性转酯化,转化率达到95.9%,产物e.e.p=98.4%,d.e.p=86.9%.第三,脂肪酶基因的克隆、高效异源表达以及氨基酸特异保守型的研究。通过构建及筛选含有6.2万个克隆子的全基因组文库,成功克隆得到全长为1521bp的脂肪酶基因(简写为LipSM54).根据进化树分析、保守序列比对以及新氧离子洞催化机理的研究,提出LipSM54与同源性较高的12个假设脂肪酶都属于一个新的细菌脂肪酶家族——LipSM54细菌脂肪酶家族。重组大肠杆菌表达的脂肪酶水解活力优化后达到4235U/L,转酯化拆分活力达到203U/L,较野生菌发酵酶活提高了3.3倍。第四,提高脂肪酶热稳定的蛋白质结构设计与改造。在远离脂肪酶活性中心的区域引入一个盐桥,导致脂肪酶高柔性区域内的氢键数目增加,来提高脂肪酶稳定性。通过蛋白质结构模拟与虚拟筛选的手段,以增加脂肪酶高柔性区域中氢键数量为目标,计算出影响脂肪酶热稳定性的关键位点信息,其中双突变脂肪酶F73R-G165D,在50℃下半衰期相比原始脂肪酶提高了924倍,催化水解反应的最适温度由35℃提高到90℃；在50%(v/v)极性溶剂中的稳定性显著提高。通过分子动力学与热力学研究发现,脂肪酶突变后形成的盐桥73R-165D,导致蛋白质结构变化,进一步新生成的6个氢键与盐桥共同增强了脂肪酶结构刚性。第五,重组脂肪酶在非水相中拆分高底物浓度4对薄荷醇混合物的过程研究。LipSM54拆分4对薄荷醇中个工艺参数的优化：正已烷为反应溶剂,乙酸乙烯酯作为酰基供体,乙酸乙烯酯与l-薄荷醇摩尔浓度比例为2：1,反应温度为35℃。在10%(w/v)底物浓度条件下,转化24小时后LipSM54催化所得产物的e.e.p>99.5%, d.e.p=90.4%.研究进一步评价了1L反应体系条件下的拆分过程,转化24小时后,获得了132mM光学纯度为90%的l-薄荷醇乙酸酯,时空产率达到1.1g/L/h,相比同类工艺,转化效率相当的条件下,产物的光学纯度更高。