维生素C(Vitamin C, Vc)’‘二步发酵法”中的第二步是通过产酸菌与伴生菌混合发酵将L-山梨糖转变成Vc的前体2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid,2-KGA)。普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)是产酸菌,负责完成糖酸转化过程,但其具有单独培养时产酸量低、生长缓慢的缺陷；伴生菌不参与糖酸转化过程,但具有促进产酸菌生长和产酸的作用。目前已经发现多种具有伴生作用的菌株,但其作用机制尚不完全清楚。因此本文针对Vc“二步发酵法”第二步混合菌发酵中两株伴生菌-巨大芽孢杆菌B.megaterium 2980、枯草芽孢杆菌B.subtilis A9对产酸菌K.vulgare 25-B-1的伴生作用机制进行了研究。(1)以枯草芽孢杆菌B.subtilis A9作为伴生菌,促进Kvulgare 25-B-1产2-KGA的能力强于工业生产用菌株——巨大芽孢杆菌B.megaterium 2980,应用前景广阔。对建立的人工神经网络模型和响应面模型比较发现,人工神经网络模型预测的数据能更好的拟合2-KGA发酵过程的实验数据,其模型具有更好的泛化能力。成功应用人工神经网络-遗传算法方法得到的2-KGA理论产量最大值为：72.54g/L,预测了2-KGA发酵培养基最佳培养基组成：L-山梨糖92.5g/L、尿素10.2g/L、玉米浆16g/L、碳酸钙3.96g/L、硫酸镁0.28g/L。在该培养条件下,经过3次重复实验得到2-KGA产量为71.21±1.53g/L。(2)利用硫酸铵分级盐析、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析、SephadexG-100凝胶过滤柱层析等技术对B.megaterium 2980、B.subtilisA9胞外上清液中的活性蛋白进行分离纯化。纯化后的蛋白组分能够同时促进产酸菌K.vulgare 25-B-1产酸并提高SDH酶活,经SDS-PAGE检测,伴生菌B.megaterium 2980得到两个条带,相对分子量分别是36kDa和43kDa；伴生菌B.subtilis A9也得到两个条带,相对分子量分别是45kDa和61kDa。(3)外源小分子营养物质的添加产生不同的促产酸效果。添加谷胱甘肽、三磷酸腺苷、含氮碱基和二氢叶酸能在一定程度上提高2-KGA产量,其主要通过增加微生物的营养物质来提高2-KGA产量：适量的叶酸、辅酶Ⅰ和甘油不能促进产酸菌K. vulgare 25-B-1合成2-KGA。而且,产酸能力强的混合菌系对外源添加的小分子营养物质格外敏感,产酸量更高。(4)两种伴生菌系不同发酵时间发酵液中的胞外氨基酸成分、B族维生素、氧化还原电位及菌液浓度的变化趋势基本相同。在混菌发酵过程中,伴生菌在芽孢生成时释放了包括甘氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、苏氨酸、天冬氨酸和异亮氨酸及盐酸吡哆醇等多种产酸菌所需的营养成分。这些营养成分是促进产酸菌生长、产酸的重要因素；混菌发酵体系中氧化还原电位变化与菌液浓度变化规律一致,都随着发酵时间的延长而提高。发酵体系中氧化还原电位的变化是发酵过程的综合体现,可以作为混菌发酵过程优化控制的参数之一(5)通过对单菌体系与两种混菌体系(K.v25-B-1+2980体系、K.v25-B-1+A9体系)总抗氧化能力、总超氧化物歧化酶、谷胱甘肽还原酶、活性氧水平、巯基含量、丙二醛含量、过氧化氢含量及抑制与产生超氧阴离子自由基含量等生理指标进行测定,结果显示：Vc发酵过程中产酸菌产生了大量的活性氧,但自身并不具备足够清除这些活性氧的能力,因此引起了氧化应激反应。而在混菌体系中伴生菌解除了产酸菌受到的氧化胁迫,清除了体系内的活性氧,为产酸菌提供了一个适合产酸与生长的环境。比较两种混菌体系得出：促产酸、促生长能力越强的伴生菌,其抵抗活性氧的能力越强。这可能是不同伴生菌促产酸能力存在差异的一个重要原因。(6)从磷脂水平分析,对产酸菌、伴生菌及混菌体系的磷脂分子进行定性研究发现,混菌培养体系中磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇都出现了在单独产酸菌及单独伴生菌培养中都未曾出现的分子,同时混菌培养体系的细胞膜通透性及ATP酶活性都强于单独产酸菌及单独伴生菌培养。产酸能力越强的混合菌系,其特有的磷脂分子组成及相对含量越多,ATP酶活性和细胞膜通透性也越强。表明,在混菌培养过程中,伴生菌的参与,使得伴生菌与产酸菌细胞膜发生变化,主动运输能力增强,有利于物质交换。