在成年的血管中,血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的主要功能是通过收缩来调节血管的张力和直径,进而调节由血压和血液的分布。VSMCs存在增殖型和收缩型两种表型。收缩型VSMCs可以表达多种平滑肌分化标志基因,例如α-肌动蛋白(smooth muscleα-actin,α-SMA)、肌球蛋白重链(SM-myosin heavy chain,MHC)、平滑肌蛋白22-α(smooth muscle protein 22-α,SM22α)。血清反应因子(serum response factor,SRF)通过募集myocardin、MRTF-A/B等辅助因子来调控平滑肌标志基因的的表达。已经证明,转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)是调节平滑肌标志基因表达的重要细胞因子。神经调节蛋白1(neuregulin-1,NRG-1)是含有表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)样结构域的神经调节蛋白家族成员之一,由NRG基因通过选择性地拼接所产生。NRG-1蛋白含有EGF样的胞外结构域和高度保守的胞内结构域(intracellular domain,NRG-1-ICD)。NRG-1被基质金属蛋白酶水解后释放出具有生物活性的可溶性EGF片段,而NRG-1-ICD进入细胞核,通过与一些转录因子相互作用而调节基因表达。此外,NRG-1-ICD含有的LIM结构域可以与和胞浆蛋白相互作用。许多研究表明,NRG-1在心血管生理及病理过程中都发挥重要作用。首先,NRG-1在血管内皮细胞中表达,而它的受体位于毗邻的平滑肌细胞上。其次,在VSMCs中,NRG-1可以抑制由血小板源性生长因子BB(platelet-derived growth factor BB,PDGF-BB)引起的细胞增殖和迁移。再次,NRG-1可以调节心肌细胞功能和参与对血流动力学稳态的调节。但是,TGF-β1诱导的VSMC分化是否需要NRG-1-ICD参与以及NRG-1-ICD如何调节VSMCs的功能目前尚无报道。环状RNA(circular RNA,circ RNA)是最近被发现的对真核基因表达具有调节功能的非编码RNA。circ RNA可以作为微小RNA(micro RNA,mi RNA)的“海绵”竞争性结合胞内mi RNA,阻断mi RNA对其靶基因的抑制作用,从而上调mi RNA靶基因的表达。除此以外,circ RNA也可通过与RNA结合蛋白(RNA-binding protein,RBP)结合,或者与其他RNA通过碱基互补结合而对特定基因发挥调节作用。已经证明,在血管组织中,circ RNA c ZNF292可以通过调节E2FI、NF-k B、Sp1、Ap1等转录因子的活性而调节血管的生成。在人的动脉粥样硬化斑块中,circ ANRIL在VSMCs和巨噬细胞中都有表达,其通过调节核糖体的合成而发挥抗动脉粥样硬化作用。然而在VSMCs中是否存在circ RNAs及circ RNAs对VSMCs的调节功能尚不清楚。因此,本研究以TGF-β1作为VSMC分化的诱导因素,探索NRG-1-ICD和circ RNA对VSMC功能的调节及作用机制。第一部分TGF-β1诱导合成的NRG-1-ICD参与VSMC细胞骨架的组构目的:探讨NRG-1是否在VSMC中进行表达以及NRG-1-ICD在VSMC中的作用。方法:1免疫荧光检查NRG-1在小鼠血管组织中的表达,Western blot和RT-PCR检测NRG-1在不同种属VSMC中的表达。2在VSMC中过表达NRG-1后,鬼笔环肽染色观察细胞骨架及肌丝的变化。3细胞形态学观察NRG-1过表达对乙酰胆碱诱导的细胞收缩的影响。4细胞免疫荧光检测NRG-1-ICD和α-SMA的共定位。5免疫共沉淀检测NRG-1、NRG-1-ICD与α-SMA的相互作用。6 GST pull-down在体外验证NRG-1/NRG-1-ICD与α-SMA的相互作用。7 PLA实验在体内观察NRG-1与α-SMA的作用。结果:1在人主动脉血管平滑肌细胞(human artery smooth muscle cell,HASMC)中,TGF-β1上调NRG-1的表达为了确定NRG-1是否在VSMC中表达,我们用NRG-1抗体对野生型C57BL/6小鼠的主动脉血管进行免疫荧光染色。结果显示,NRG-1与平滑肌细胞的标志蛋白α-SMA共定位。Western blot和RT-PCR结果显示,NRG-1的m RNA和蛋白在大鼠VSMC,HASMC以及人血管内皮细胞中都有表达。已知TGF-β1和PDGF-BB调节VSMC标志基因的表达,但它们是否影响NRG-1的表达目前尚不清楚。分别用10 ng/m L的PDGF-BB和2ng/m L的TGF-β1刺激细胞不同时间(0、6、12、24 h)。提取总RNA和总蛋白进行Real-time PCR和Western blot分析。结果显示,随着PDGF-BB刺激时间的延长,NRG-1的表达逐渐降低。相反,随着TGF-β1刺激时间的延长,NRG-1的表达逐渐增加。2 NRG-1-ICD参与细胞骨架的组构为了研究NRG-1在VSMC中的作用,用携带NRG-1基因的腺病毒感染细胞24 h后,观察细胞骨架的变化。鬼笔环肽染色结果显示,过表达NRG-1可以促进肌丝成束,使应力纤维增粗。因为NRG-1含有EGF样的胞外结构域(ECD)和胞内结构域(ICD),我们进一步检查NRG-1的哪个结构域对细胞骨架发挥调节作用。结果发现,用HRG-β1(可溶性活性成分)处理细胞时,细胞骨架不发生明显的变化。然而,过表达NRG-1-ICD后,细胞骨架出现束状排列。这些结果表明,NRG-1对细胞骨架的组构主要是通过NRG-1-ICD实现的。我们还发现,过表达NRG-1可以促进乙酰胆碱诱导的细胞收缩3 TGF-β1促进NRG-1/NRG-1-ICD与α-SMA的相互作用为了进一步检查NRG-1-ICD参与细胞骨架的组构是否和其与α-SMA相互作用有关,我们用检测蛋白质相互作用的实验检查二者的结合。细胞免疫荧光结果显示,在未经TGF-β1处理的HASMC中,NRG-1-ICD和α-SMA表达水平较低。TGF-β1刺激12 h后,二者的表达明显增加,而且二者在细胞浆中共定位。从被TGF-β1刺激后的HASMC中提取蛋白质,经抗α-SMA抗体免疫沉淀后,用抗NRG-1和抗NRG-1-ICD的抗体进行Western blot分析。结果显示,在基础水平时,NRG-1/NRG-1-ICD均与α-SMA结合,TGF-β1刺激12 h后,二者之间的结合明显增加。GST pull-down实验进一步证实,在TGF-β1可以直接增强NRG-1/NRG-1-ICD与α-SMA的相互作用,与免疫共沉淀的结果相一致。PLA实验结果也显示,NRG-1与α-SMA存在相互作用。这些结果表明,NRG-1-ICD通过与α-SMA的相互作用而调节细胞骨架的组构。小结:综上所述,TGF-β1可在转录和翻译水平上上调NRG-1表达;NRG-1的ICD结构域通过与α-SMA相互作用调节细胞骨架组构,参与细胞收缩;TGF-β1促进NRG-1/NRG-1-ICD与α-SMA的相互作用。第二部分circ ACTA2介导NRG-1-ICD对α-SMA表达的调节目的:揭示NRG-1-ICD调节α-SMA表达的作用机制。方法:1细胞免疫荧光检测NRG-1-ICD的细胞定位。2 Ch IP法检测NRG-1-ICD在α-SMA基因第一内含子上的富集。3荧光素酶报告基因分析鉴定NRG-1-ICD在α-SMA基因第一内含子上的结合位点。4分别在HASMC中过表达或敲低NRG-1-ICD,Western blot检测α-SMA的表达变化。5 q RT-PCR检测过表达NRG-1-ICD后α-SMA m RNA表达变化。6 RT-PCR和RNase R处理后,q RT-PCR检测线性和环状RNA。7 CRISPRi封闭NRG-1-ICD结合位点,q RT-PCR检测circ ACTA2和α-SMA m RNA的变化。8过表达NRG-1-ICD后再给与TGF-β1刺激,q RT-PCR检测circ ACTA2的表达。9 Western blot检测过表达或敲低circ ACTA2对α-SMA表达的影响。结果:1在HASMC中,NRG-1-ICD上调α-SMA的表达细胞免疫荧光染色显示,在静止的HASMC中,NRG-1-ICD在胞浆和胞核均有分布,但以胞浆居多。TGF-β1刺激12 h后,NRG-1-ICD在胞浆和胞核中都增多,胞核中增加更为明显。为了确定NRG-1-ICD的作用位点,我们进行了Chromatin Immunoprecipitation Sequencing(Ch IP-Seq)分析。在TGF-β1刺激细胞12 h后,用NRG-1-ICD抗体沉淀染色质片段。高通量测序与数据分析的结果显示,TGF-β1刺激后,α-SMA基因第一内含子(+5642 bp/+5787 bp区域)的DNA片段被NRG-1-ICD抗体所沉淀。我们进一步用Ch IP-q PCR实验对Ch IP-Seq结果进行验证,发现TGF-β1刺激后,NRG-1-ICD与α-SMA基因第一内含子+5642 bp/+5787bp的相互作用增强。构建NRG-1-ICD-binding site和NRG-1-ICD-binding site mut荧光素酶报告基因载体,与NRG-1-ICD表达质粒共转染293A细胞后,观察NRG-1-ICD过表达对报告基因表达的影响。结果显示,过表达NRG-1-ICD后,野生型NRG-1-ICD-binding site指导报告基因表达的活性明显升高,但是突变位点对荧光素酶表达没有明显影响。这些结果说明,NRG-1-ICD通过与α-SMA基因第一内含子区+5642 bp/+5787 bp的相互作用上调α-SMA表达。为了进一步明确NRG-1-ICD在TGF-β1促进α-SMA表达中的作用,我们用携带NRG-1-ICD基因的腺病毒感染细胞后,再给予TGF-β1刺激24 h,观察α-SMA的表达。Western blot结果显示,TGF-β1可以诱导α-SMA的表达,NRG-1-ICD过表达可进一步增加α-SMA的表达水平。利用靶向NRG-1-ICD的si RNA转染HASMC 24 h,检测TGF-β1对α-SMA的影响。结果显示,敲低NRG-1-ICD后,α-SMA表达水平明显降低,即使再给予TGF-β1处理仍不能恢复α-SMA的表达水平。此外,我们还发现,过表达NRG-1-ICD不影响α-SMA m RNA水平。2 NRG-1-ICD诱导circ ACTA2的形成上述实验结果表明,NRG-1可以上调α-SMA的蛋白水平,但不影响其m RNA。由此,我们推测,NRG-1可能在转录后水平上通过mi RNA或者是circ RNA对α-SMA表达起调控作用。为了验证这个假说,我们设计针对circ ACTA2反向连接处的引物,以互补DNA(c DNA)和基因组DNA(g DNA)为模板进行RT-PCR。结果显示,以c DNA为模板可以扩增出circ ACTA2连接处的DNA片段,而以g DNA为模板却不能扩增出此片段。由于circ RNA的环状结构对核糖核酸酶R(RNase R)不敏感,线性RNA则不然,所以利用RNase R处理可以区别circ RNA与线性RNA。结果发现,RNase R处理使线性ACTA2(α-SMA m RNA)降低90%,而circ ACTA2只降低40%。我们用针对全长circ ACTA2的引物进行RT-PCR,结果显示,全长circ ACTA2的长度约为730 bp。这些结果说明,HASMC中存在circ ACTA2。为了研究NRG-1-ICD是否可以影响circ ACTA2的形成,我们用CRISPR interference(CRISPRi)封闭技术,即用d Cas9+g RNA阻断RNA聚合酶II与NRG-1-ICD结合位点结合后,观察circ ACTA2表达变化。合成一段与NRG-1-ICD结合位点互补的单链g RNA,它通过介导Cas9酶与α-SMA基因第一内含子结合而阻断转录的起始及延伸。q RT-PCR结果显示,封闭NRG-1-ICD结合位点后circ ACTA2表达降低,而α-SMA m RNA没有变化。并且我们还发现,单独给予TGF-β1刺激或者过表达NRG-1-ICD均可以使circ ACTA2的表达增高,同时给予二者时,会进一步增加circ ACTA2的表达水平。3 circ ACTA2介导TGF-β1对α-SMA表达的诱导作用我们设计两个si RNA,一个特异性敲低circ ACTA2(si-circ ACTA2),另一个是同时敲低环状和线状ACTA2(si-both)。结果发现,单独敲低circ ACTA2不影响α-SMA m RNA水平;同时敲低环状和线状RNA时,会使circ ACTA2和α-SMA m RNA的水平均下降。Western blot结果显示,过表达或者敲低circ ACTA2分别增加或降低α-SMA蛋白水平。为了进一步验证circ ACTA2是否介导TGF-β1对α-SMA蛋白表达的影响,我们过表达circ ACTA2后再给予TGF-β1处理,结果发现,过表达circ ACTA2可以进一步增强TGF-β1对α-SMA表达的上调作用。反之,敲低circ ACTA2则降低TGF-β1对α-SMA表达的诱导。小结:综上所述,circ ACTA2介导TGF-β1和NRG-1-ICD对α-SMA表达的调节。第三部分circ ACTA2通过吸附mi R-548f-5p上调α-SMA表达及调节HASMC功能目的:揭示circ ACTA2调节α-SMA表达及VSMC功能的分子机制。方法:1构建带有荧光素酶活性的野生型pmir GLO-circ ACTA2和突变型pmir GLO-circ ACTA2 mut质粒,转染293A细胞后进行双荧光素报告基因分析。2生物素标记circ ACTA2和mi R-548f-5p,经oligo-pull down和q RT-PCR检测被富集的mi R-548f-5p和circ ACTA2。3原位杂交检查mi R-548f-5p和circ ACTA2在细胞中的共定位。4合成α-SMA 3’UTR及其突变体DNA片段,克隆进pmir-GLO载体质粒,转染293A细胞后进行报告基因分析。5过表达或敲低mi R-548f-5p,Western blot观察α-SMA蛋白的表达水平。6分别过表达NRG-1-ICD敲低circ ACTA2或mi R-548f-5p后,western blot检测α-SMA蛋白的表达。7观察NRG-1-ICD、circ ACTA2、mi R-548f-5p对乙酰胆碱诱导的细胞收缩的影响。结果:1 circ ACTA2作为分子“海绵”吸附mi R-548f-5p用生物信息学技术预测circ ACTA2上micro RNA的结合位点,发现circ ACTA2上存在1个mi R-548f-5p的潜在结合位点,暗示circ ACTA2可能与mi R-548f-5p相互作用。我们构建带有荧光素酶基因的野生型pmir GLO-circ ACTA2和突变型pmir GLO-circ ACTA2 mut质粒,将其与mi R-548f-5p模拟物共转染293A细胞。报告基因分析结果显示,野生型pmir GLO-circ ACTA2指导的荧光素酶活性能被mi R-548f-5p模拟物所抑制,但mi R-548f-5p模拟物对突变型pmir GLO-circ ACTA2 mut指导的荧光素酶活性没有影响。用生物素标记的circ ACTA2对RNA提取物进行oligo-pull down,q RT-PCR分析其富集的mi RNAs。结果显示,与对照探针组相比,circ ACTA2探针组的mi R-548f-5p富集量明显增加。反之,用标记生物素的mi R-548f-5p作为探针,经oligo-pull down和q RT-PCR分析被mi R-548f-5p富集的circ RNAs。结果表明,与对照探针组相比,mi R-548f-5p探针组的circ ACTA2富集量也有所增加。原位杂交实验也证实circ ACTA2在细胞内与mi R-548f-5p共定位。此外,TGF-β1刺激和NRG-1-ICD过表达都可以使mi R-548f-5p的表达水平降低,二者联合时降低更为显著。这些结果表明,circ ACTA2可以作为分子“海绵”吸附mi R-548f-5p。2在VSMC中,mi R-548f-5p通过靶向α-SMA 3’UTR而抑制其蛋白表达我们发现,α-SMA 3’非编码区(UTR序列)含有mi R-548f-5p的结合位点。将含有mi R-548f-5p结合位点的α-SMA及其突变体3’UTR克隆到携带荧光素酶基因的pmir-GLO质粒上,转染293A细胞后进行荧光素酶活性分析。结果显示,含有野生型mi R-548f-5p结合位点的报告基因的表达活性能被mi R-548f-5p模拟物所抑制,而其突变体不能被模拟物所抑制。分别用mi R-548f-5p的模拟物和抑制物转染HASMC,q RT-PCR证实mi R-548f-5p在细胞中得到过表达和敲低。Western blot结果显示,mi R-548f-5p mimic能使α-SMA蛋白表达水平显著降低,而anti-mi R-548f-5p对α-SMA蛋白表达影响不大。以上结果表明,在HASMC中,mi R-548f-5p通过直接与α-SMA 3’UTR结合来抑制其蛋白的表达。3 NRG-1/circ ACTA2/mi R-548f-5p形成调节轴共同调节VSMC的收缩功能在HASMC中,用si RNA靶向敲低circ ACTA2后再用腺病毒过表达NRG-1-ICD,检查其对α-SMA表达的影响。结果表明,敲低circ ACTA2能显著抑制NRG-1-ICD过表达对α-SMA表达的上调。相反,过表达circ ACTA2则进一步增加NRG-1-ICD过表达对α-SMA表达的上调。这些结果表明,circ ACTA2介导NRG-1-ICD对α-SMA表达的上调作用。共表达circ ACTA2和NRG-1-ICD可以显著增加乙酰胆碱诱导的细胞收缩。我们进一步用mi R-548f-5p的抑制物和靶向circ ACTA2的si RNA转染细胞,检查其对α-SMA表达的影响。结果显示,用anti-mi R-548f-5p拮抗mi R-548f-5p的作用后,α-SMA蛋白表达水平明显增加。然而,敲低circ ACTA2则明显抑制α-SMA的表达。相反,circ ACTA2过表达增加α-SMA的表达,并且过表达circ ACTA2和抑制mi R-548f-5p可进一步增加α-SMA的表达水平。这些结果表明,circ ACTA2可以作为分子“海绵”吸附mi R-548f-5p,解除其对靶基因α-SMA的抑制。我们还发现,过表达circ ACTA2和抑制mi R-548f-5p可以增加乙酰胆碱诱导的细胞收缩。这些结果提示,NRG-1、circ ACTA2和mi R-548f-5p形成调节轴共同对α-SMA表达和VSMC功能发挥调节作用。小结:circ ACTA2作为分子“海绵”吸附mi R-548f-5p,解除其对靶基因α-SMA的抑制作用;NRG-1、circ ACTA2和mi R-548f-5p形成调节轴共同调节α-SMA表达及VSMC的收缩功能。结论:1 TGF-β1可在转录和翻译水平上上调NRG-1表达,NRG-1的ICD结构域通过与α-SMA相互作用调节细胞骨架组构,参与细胞收缩。2 circ-ACTA2介导TGF-β1和NRG-1-ICD对α-SMA表达的调节。3 circ ACTA2作为分子“海绵”吸附mi R-548f-5p,解除其对靶基因α-SMA的抑制作用。4 NRG-1、circ ACTA2和mi R-548f-5p形成调节轴共同调节α-SMA表达及VSMC的收缩功能。